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Nature Communications volumen 13, número de artículo: 7962 (2022) Citar este artículo

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La actividad d,d-transpeptidasa de las proteínas fijadoras de penicilina (PBP) es el objetivo principal bien conocido de los antibióticos β-lactámicos que bloquean la polimerización de peptidoglicanos. La destrucción bacteriana inducida por β-lactámicos implica respuestas complejas cuyas causas y consecuencias son difíciles de resolver. Aquí, utilizamos el reemplazo funcional de PBP por una l, d-transpeptidasa insensible a β-lactámicos para identificar genes esenciales para mitigar los efectos de la inactivación de PBP por β-lactámicos en bacterias que se dividen activamente. Las funciones de los 179 genes condicionalmente esenciales identificados mediante este enfoque se extienden mucho más allá de los socios de la l,d-transpeptidasa para la polimerización de peptidoglicanos para incluir proteínas involucradas en la respuesta al estrés y en el ensamblaje de polímeros de la membrana externa. Los efectos insospechados de los β-lactámicos incluyen la pérdida del enlace covalente mediado por lipoproteínas que une la membrana externa al peptidoglicano, la desestabilización de la envoltura celular a pesar del entrecruzamiento efectivo del peptidoglicano y el aumento de la permeabilidad de la membrana externa. Este último efecto indica que el modo de acción de los β-lactámicos implica una penetración autopromocionada a través de la membrana externa.

Las bacterias gramnegativas, como Escherichia coli, poseen una envoltura multicapa que sostiene la presión de turgencia del citoplasma (peptidoglicano de la pared celular) y actúa como una barrera química selectiva para nutrientes, desechos y compuestos tóxicos (membranas internas y externas) (Fig. 1a)1. Varios polímeros que contienen proteínas, péptidos, glucanos y restos de lípidos garantizan las propiedades mecánicas y las funciones de transporte de la envoltura. El peptidoglicano (PG), que está unido covalentemente a la membrana externa a través de la lipoproteína de Braun, es una macromolécula gigante en forma de red (ca. 109 Da) polimerizada a partir de una unidad disacárido-pentapéptido (Fig. 1b). Las glicosiltransferasas catalizan la formación de enlaces glicosídicos β-1,4 entre disacáridos para formar cadenas de glicano que posteriormente se entrecruzan entre sí mediante transpeptidasas (Fig. 1c). Estas últimas enzimas, las d,d-transpeptidasas, también se conocen como proteínas fijadoras de penicilina (PBP), ya que son los objetivos esenciales de los antibióticos β-lactámicos. Para la polimerización de peptidoglucano, las PBP interactúan con el extremo d-Ala4-d-Ala5 de un tallo de pentapéptido (de ahí la designación d,d) y forman un enlace covalente entre d-Ala4 y su residuo Ser del sitio activo con la liberación concomitante de d -Ala5. En el siguiente paso, la acilenzima resultante reacciona con el segundo sustrato, generalmente un tallo tetrapeptídico, para formar un dímero Tetra-Tetra reticulado 4 → 3 con la liberación concomitante de la PBP (Fig. 1c; Fig. Suplementaria). S1a)2. En cooperación con las proteínas de andamiaje y las endopeptidasas, las d,d-transpeptidasas median la inserción de cadenas de glucano en la macromolécula en forma de red de PG en expansión, determinando así la forma bacteriana y asegurando una barrera mecánica contra la presión osmótica del citoplasma durante toda la célula. ciclo3,4,5,6,7.

a La envoltura está compuesta por membranas interna (IM, gris) y externa (OM, negra). El peptidoglicano (PG, azul) garantiza la protección osmótica de la célula bacteriana. La MI es una bicapa lipídica compuesta principalmente por fosfolípidos (PL). La MO es una bicapa lipídica asimétrica: la valva interna está compuesta por PL y la valva externa por lipopolisacáridos (LPS) y fosfatidilglicéridos sustituidos por el antígeno común enterobacteriano (ECAPGL). b Estructura de la subunidad PG (GlcNAc, N-acetil-glucosamina; MurNAc, ácido N-acetil-murámico). c PG es una macromolécula en forma de red hecha de cadenas de glicano (polígonos azul-violeta) entrecruzadas por tallos peptídicos cortos (círculos de colores). Las PBP catalizan la formación de 4 → 3 enlaces cruzados que conectan la cuarta posición de un vástago donante de acilo con la tercera posición del aceptor. Dos miembros de la familia LDT (YcbB e YnhG) catalizan la formación de enlaces cruzados 3 → 3. Tres LDT (ErfK, YbiS e YcfS) anclan la lipoproteína de Braun (Lpp) al PG. La vinculación de DAP en la tercera posición de un vástago donante de PG con la extremidad Arg-Lys de Lpp proporciona un vínculo covalente entre el OM y el PG. El enlace PG-Lpp es hidrolizado por YafK LDT46,47. d Perfil rpHPLC de muropéptidos de la cepa BW25113 (ycbB, relA ') cultivada sin ceftriaxona. La estructura se infiere a partir de los fragmentos obtenidos por digestión de PG con muramidasas que escinden el enlace MurNAc-GlcNAc β-1,4. e Estructura de los muropéptidos deducida de análisis de espectrometría de masas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La evitación de la actividad d,d-transpeptidasa de las PBP mediante l,d-transpeptidasas (LDT) estructuralmente no relacionadas da como resultado resistencia a la mayoría de los β-lactámicos8,9. Las l, d-transpeptidasas escinden el enlace peptídico l, d mesoDAP3-d-Ala4 de los tallos tetrapeptídicos y forman enlaces cruzados 3 → 3 (Fig. 1c; Fig. complementaria S1b) 10. Otros miembros de la familia l,d-transpeptidasa son responsables del anclaje de la lipoproteína de Braun al PG (Figura complementaria S1c)11. La activación de la vía de polimerización de la 1,d-transpeptidasa PG, en su mayoría críptica, se descubrió por primera vez en mutantes de Enterococcus faecium resistentes a β-lactámicos seleccionados in vitro12,13. La l,d-transpeptidación es el modo principal de entrecruzamiento de PG en Mycobacterium tuberculosis patógeno14 y puede ser el objetivo de quimioterapias de tercera línea basadas en el β-lactámico meropenem15. En E. coli, la activación de la vía requiere una sobreproducción tanto de la YcbB l,d-transpeptidasa (LdtD) como de la guanosina penta o tetrafosfato (p)ppGpp alarmona8. Posteriormente se informó que YcbB participaba en el mantenimiento de PG ya que compensaba defectos en la exportación de lipopolisacáridos16.

La actividad d,d-transpeptidasa de las PBP fue identificada como el objetivo principal de los β-lactámicos en la década de 196017. Sin embargo, descifrar la cascada de eventos que conducen a la muerte bacteriana plantea desafíos particulares18,19,20,21. Este tema sigue siendo objeto de intensas investigaciones.

En este trabajo, investigamos las funciones que son esenciales para el rescate de la actividad de entrecruzamiento 4 → 3 de las PBP inactivadas por β-lactámicos mediante la actividad de entrecruzamiento 3 → 3 de la l,d-transpeptidasa YcbB a escala del genoma. . Los resultados se basan en la identificación Tn-seq de genes esenciales para la resistencia a los β-lactámicos mediada por YcbB, la construcción de múltiples eliminaciones de genes para descifrar las relaciones epistáticas y la determinación de la estructura de PG mediante espectrometría de masas (Fig. 1d, e). Este análisis abre una nueva ventana sobre la capacidad de evolución de la envoltura celular, sobre la compleja red de interacciones que pertenecen a la homeostasis de los polímeros de la envoltura y sobre los mecanismos que desarrolla E. coli para luchar contra el estrés inducido por la acción mediada por β-lactámicos. Inactivación de la d,d-transpeptidasa.

Se utilizó un enfoque de secuenciación de transposones (Tn-seq)22 para identificar genes esenciales para la resistencia a β-lactámicos mediada por YcbB en el genoma de E. coli BW25113(ycbB, relA')8. Esta cepa combina un alto nivel de producción de 1,d-transpeptidasa YcbB y de (p)ppGpp sintetasa RelA' tras la inducción por IPTG y 1-arabinosa de los genes ycbB y relA', respectivamente. Se compararon dos condiciones experimentales, ausencia (-CRO) o presencia (+CRO) de ceftriaxona. Se eligió la β-lactámica ceftriaxona para nuestro análisis ya que esta cefalosporina de tercera generación de amplio espectro es altamente efectiva para inactivar todas las d,d-transpeptidasas pertenecientes a la familia PBP y es específica de estas enzimas ya que las l,d-transpeptidasas no se inactivan debido a una combinación de acilación ineficaz y formación de una acilenzima propensa a la hidrólisis23,24. Para ambas condiciones, se agregaron IPTG y l-arabinosa para inducir genes que codifican la YcbB l,d-transpeptidasa y la RelA' (p)ppGpp sintasa, respectivamente. La extracción de ADN genómico se realizó en grupos de 810.000 (-CRO) y 260.000 (+CRO) transformantes y se secuenció. Los duplicados técnicos de extracciones de ADN independientes revelaron coeficientes de correlación R2 de 0,90 y 0,94 para las condiciones −CRO y +CRO, respectivamente (Fig. 2a, b). Las secuencias que contienen uniones se alinearon con el genoma de referencia de E. coli BW25113 y los genes esenciales se identificaron cuantificando la presencia de espacios en las inserciones (Fig. 2c). Se compararon los números promedio de lecturas por gen para identificar genes en los que las inserciones de transposones estaban significativamente subrepresentadas (valor de p <0,05) en la condición + CRO (Fig. 2d; Archivo de datos complementarios 1a).

a, b Correlación de números de lectura promedio normalizados por CDS para dos réplicas técnicas secuenciadas obtenidas para las condiciones −CRO y +CRO, respectivamente. c Frecuencia y ubicación de las inserciones de transposones. Los anillos, del más externo al más interno, corresponden a: (i) las coordenadas BW25113; (ii) los CDS sentido (gris claro) y antisentido (gris); (iii) el log2 del cambio de inserción para las condiciones −CRO versus +CRO. Los datos para las proporciones −CRO a +CRO menores y mayores que 1 aparecen en amarillo y morado, respectivamente; y (iv) los CDS sentido y antisentido específicamente esenciales en la condición +CRO, respectivamente. d El gráfico del volcán representa genes para los cuales la inactivación de transposones es beneficiosa o perjudicial en la condición +CRO. El eje X representa el log2 del cambio de las lecturas promedio por gen para las condiciones −CRO versus +CRO. El eje Y representa el log10 negativo del valor p obtenido de la prueba t de dos colas no apareada. El área rosada corresponde a genes con un número de inserciones al menos 4 veces menor en la condición +CRO con un valor de p <0,05. e Funciones biológicas de genes específicamente esenciales en la condición +CRO. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los análisis de Tn-seq revelaron que entre los 4309 CDS anotados, 179 eran selectivamente esenciales en la condición +CRO de acuerdo con una combinación estricta de tres criterios que incluyen (i) la presencia de una brecha en las inserciones de transposones, (ii) una p- significativa valor (<0,05), y (iii) un cambio de pliegue mayor que 4 (ver "Métodos") (Archivo de datos complementarios 1b). No se encontró que ningún gen fuera selectivamente esencial en la condición −CRO. Los 179 + genes selectivamente esenciales de CRO se asignaron a siete categorías funcionales y se encontró que la mayoría estaba involucrada en el metabolismo de los componentes de la envoltura (N = 71, 40%) y en las respuestas al estrés (N = 35, 20%) (Fig. 2e ). Los perfiles Tn-seq relevantes de los genes discutidos en este estudio se compilaron en el Archivo de datos complementario 2.

La síntesis del tabique está mediada por componentes del divisoma que se reclutan en la mitad de la célula mediante el ensamblaje del anillo FtsZ (Fig. 3a)6. Las proteínas del divisoma central, FtsA, FtsEX, FtsQLB, FtsW, FtsZ, ZipA y PBP3, fueron esenciales tanto en las condiciones −CRO como en +CRO. Por el contrario, las proteínas asociadas al divisoma participan en el control del ciclo celular (MinCD, FtsK)25,26, en la estabilización del divisoma en condiciones de estrés (FtsP)27,28,29 y en proporcionar un vínculo físico con el la membrana externa (TolABQR y Pal) 30 solo fueron esenciales en la condición + CRO (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2).

a, b Representación esquemática del divisoma y elongasoma, respectivamente. c Perfiles de inserción Tn-seq de genes que codifican componentes del elongasoma. Los marcos de lectura se indican en la parte inferior del panel y están codificados por colores: rojo, genes selectivamente esenciales para +CRO; verde, genes esenciales tanto para −CRO como para +CRO; gris, genes no esenciales en ninguna de las condiciones. Los sitios de inserción de transposones se indican mediante líneas encima de los marcos de lectura y su altura refleja el número de lecturas para cada inserción. d Esencialidad de los genes que codifican los componentes del elongasoma PBP2 y RodA probados mediante mutagénesis dirigida al sitio. La eficiencia del cultivo en placas se probó en presencia de ceftriaxona a 8 µg/ml (+ceftriaxona) o sin fármaco (-ceftriaxona) en placas de agar BHI suplementadas con IPTG 40 µM y L-arabinosa al 1% para la inducción de ycbB y relA', respectivamente. Las placas se incubaron a 28 °C ya que las cepas que albergaban mrdA S330A y mrdA S330C no crecieron en presencia de ceftriaxona a 37 °C.

La expansión de la pared lateral del peptidoglicano está mediada por el elongasoma (Fig. 3b), que incluye (i) RodA, una glicosiltransferasa que pertenece a la familia de proteínas de forma, elongación, división y esporulación (SEDS), (ii) PBP2, una PBP de clase B catalíticamente monofuncional con actividad d,d-transpeptidasa, y (iii) MreB, una proteína similar a la actina que forma un citoesqueleto de andamiaje para el complejo elongasoma6.

Análisis previos establecieron que el elongasoma es prescindible para el crecimiento en mutantes que sobreproducen la alarmona (p)ppGpp31,32. Como se esperaba, el análisis Tn-seq indicó que cada uno de los seis genes del elongasoma (mrdA, rodA, rodZ, mreB, mreC y mreD) eran prescindibles para el crecimiento en la condición −CRO, que incluía l-arabinosa para la producción de (p) ppGpp por RelA '(Fig. 3c). El crecimiento de los mutantes elongasoma dependía además de la expresión del gen relA '(p)ppGpp sintasa (Figura complementaria S2a). Sorprendentemente, los seis genes del elongasoma fueron esenciales en la condición + CRO a pesar de la producción de (p) ppGpp (Fig. 3c). La esencialidad de PBP2 (codificada por mrdA) fue inesperada dado que esta PBP no podía participar directamente en el entrecruzamiento de PG debido a la inactivación de su dominio d,d-transpeptidasa por la ceftriaxona8,33. Los componentes del elongasoma están codificados por grupos de genes compactos que son altamente sensibles a los efectos polares que potencialmente alteran los niveles de transcripción de genes adyacentes. Por lo tanto, complementamos nuestros resultados de Tn-seq utilizando un enfoque CRISPR-Cas9 (Figura complementaria S2b) para la mutagénesis de mrdA dirigida al sitio en un solo paso para alterar la actividad transpeptidasa de PBP2. La expresión de resistencia a la ceftriaxona se eliminó mediante la eliminación de mrdA, pero no mediante la sustitución del residuo catalítico Ser de la d, d-transpeptidasa por Ala o Cys (Fig. 3d; Fig. Suplementaria S2c). Por tanto, la PBP2, pero no su actividad transpeptidasa, era esencial para la resistencia a los medicamentos.

Un enfoque CRISPR-Cas9 similar, aplicado a la mutagénesis del gen rodA de la glicosiltransferasa, reveló que se necesitaba una forma catalíticamente activa de la glicosiltransferasa para el crecimiento en presencia de ceftriaxona (Fig. 3d; Fig. Suplementaria S2c). Anteriormente se demostró que PBP2, RodZ, MreB, MreC y MreD son esenciales para el ensamblaje del elongasoma, y ​​que la interacción entre PBP2 y RodA no depende de la actividad de PBP234,35,36. Por lo tanto, el entrecruzamiento de PG por YcbB requirió la polimerización de cadenas de glicano por RodA en un elongasoma funcional que contiene tanto RodA como PBP2, siendo prescindible la actividad transpeptidasa de esta última enzima.

En E. coli, entre el 40% y el 50% del PG se degrada por generación y >90% de los muropéptidos resultantes son reciclados por la célula37,38. Esto implica el transporte retrógrado de fragmentos de PG al citoplasma mediante permeasas especializadas, AmpG y el complejo Opp, seguido del reciclaje de los restos de azúcar y péptidos como glucosamina y tripéptido l-Ala-γ-d-Glu-DAP, respectivamente (Fig. .4a). El análisis Tn-seq mostró que los genes que codifican la permeasa AmpG y cada componente del complejo Opp eran completamente prescindibles para el crecimiento tanto en condiciones −CRO como +CRO. Además, demostramos que el reciclaje de PG era totalmente prescindible mediante la construcción de un mutante triple ΔampG ΔoppF ΔmppA que resultó viable y resistente a la ceftriaxona a pesar de la pérdida de ambos transportadores (Figura complementaria S3a). Sin embargo, la l, d-carboxipeptidasa LdcA citoplasmática fue esencial en la condición + CRO pero no en la condición −CRO (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2). Anteriormente se demostró que esta enzima recorta d-Ala4 de tallos de tetrapéptidos reciclados para proporcionar el tripéptido 1-Ala-γ-d-Glu-DAP que la ligasa Mpl agrega directamente a UDP-MurNAc39,40. Se informó que la alteración del gen que codifica LdcA da como resultado una bacteriólisis durante el crecimiento estacionario, atribuida a una dramática disminución de la reticulación, ya que los tallos de tetrapéptidos reciclados no pueden servir como donantes de acilo por las d,d-transpeptidasas (Figura complementaria S1)40. La misma explicación no puede explicar el papel esencial de LdcA en la resistencia a ceftriaxona, ya que YcbB utiliza tallos de tetrapéptidos como donantes de acilo8. No obstante, el papel esencial de LdcA en la condición + CRO surgió de la eliminación de tetrapéptidos importados, ya que la eliminación del gen mpl restableció el crecimiento del mutante ΔldcA en presencia de ceftriaxona (Figura complementaria S3a). La sobreexpresión de murA, que codifica la enzima que cataliza el primer paso comprometido de la síntesis de PG (Fig. 4a), también restauró la resistencia del mutante ΔldcA (Fig. Suplementaria S3b). Por lo tanto, aumentar el flujo metabólico a través de la vía de ensamblaje de PG compensa la toxicidad de los tetrapéptidos importados. En conjunto, estos resultados indican que Mpl liga el tetrapéptido a UDP-MurNAc y que, en ausencia de LdcA, los precursores que contienen tetrapéptidos resultantes se utilizan de manera ineficaz en los pasos posteriores de síntesis de PG y perjudican la eficacia global de la vía.

a La subunidad PG se ensambla mediante síntesis de novo (izquierda) y reciclaje de fragmentos de PG (derecha). b Síntesis de precursores de azúcares nucleótidos del ácido colánico. c Ensamblaje de la subunidad de ácido colánico unida al transportador lipídico de undecaprenilo. d Polimerización y transporte de ácido colánico a la superficie celular. Abreviaturas: Ac acetilo; vehículo lipídico de undecaprenilo C55; Membrana interna IM; membrana exterior OM; fosfato P; Pirpiruvato.

Se informó que DapF, que convierte 1,1-DAP en mesoDAP, es prescindible para el crecimiento en E. coli41. La ligasa MurE cataliza la adición de 1,1-DAP a UDP-MurNAc-l-Ala-d-Glu, aunque con menos eficacia que la adición de mesoDAP debido a una diferencia de 3000 veces en Km41. La eliminación del gen que codifica DapF da como resultado la incorporación de 1,1-DAP en precursores de peptidoglicano. Los péptidos madre que contienen 1,1-DAP fueron utilizados de manera ineficaz como donantes de acilo por las PBP, pero no como aceptores41. La reticulación general del peptidoglicano se redujo moderadamente41. Concordantemente, 1, 1-DAP fue fuertemente discriminado contra mesoDAP por PBP1b purificada in vitro42. En nuestro estudio, dapF no fue esencial en la condición −CRO. Por el contrario, no se encontraron inserciones de transposones en este gen en la condición +CRO (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2). Se detectó la formación de 3 → 3 dímeros reticulados en un mutante ΔdapF (Figura complementaria S4), pero el análisis de espectrometría de masas no permitió discriminar entre los dos estereoisómeros DAP. Nuestro análisis de peptidoglucano mostró además que la eliminación de dapF no impidió el anclaje de la lipoproteína de Braun al PG (Figura complementaria S4). Por lo tanto, las 1,d-transpeptidasas, de manera similar a las PBP, toleraron hasta cierto punto la incorporación de 1,1-DAP en precursores de peptidoglicano después de la eliminación de dapF. La esencialidad de dapF en la condición +CRO podría explicarse por una eficacia reducida de la vía de ensamblaje de PG, como se observó anteriormente para el mutante nulo ldcA.

A excepción de dapF, todos los genes que codifican enzimas involucradas en los pasos biosintéticos de PG que se sabe que son realizados por una sola enzima se identificaron como esenciales en las condiciones + CRO y −CRO (Fig. 4a). Los datos de los pasos biosintéticos esenciales que involucran funciones enzimáticas redundantes se informan en la figura complementaria S5.

El polímero más externo de la pared celular de la mayoría de las cepas de E. coli es una cápsula hecha de ácido colánico43. WcaJ cataliza el primer paso comprometido en el ensamblaje del precursor del ácido colánico. El gen que codifica WcaJ no era esencial en las condiciones −CRO y +CRO, lo que indica que la ausencia de la cápsula era compatible para el crecimiento tanto en ausencia como en presencia de ceftriaxona (Fig. 4b-d). Inesperadamente, todas las demás enzimas en la vía de síntesis del ácido colánico fueron esenciales en las condiciones +CRO pero no en las condiciones -CRO (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2). Dado que se espera que la pérdida de todas las demás enzimas de biosíntesis del ácido colánico dé como resultado la acumulación de precursores unidos a undecaprenilo, llegamos a la conclusión de que estas enzimas son esenciales para prevenir el secuestro del portador lipídico. Según este modelo, el secuestro de C55 inhibiría indirectamente el ensamblaje de otros polímeros, como el PG esencial, que dependen del mismo transportador lipídico. Como confirmación, demostramos que la eliminación del gen que codifica WcaJ, que cataliza el primer paso comprometido de la síntesis del precursor del ácido colánico, restauró el crecimiento de un mutante WcaI en presencia de ceftriaxona (Figura complementaria S6a). Combinados, estos resultados indican que la cápsula, en sí misma, no es esencial para el crecimiento en presencia de ceftriaxona, aunque las enzimas biosintéticas del ácido colánico son esenciales para prevenir la reducción de la síntesis de PG mediante el secuestro del portador lipídico.

Se ensamblan tres polímeros de ECA a partir del mismo precursor unido a C55 (Fig. 5)44. Los ECA compuestos de 1 a 14 unidades del precursor están unidos covalentemente a lipopolisacáridos (ECALPS) o a fosfatidilglicéridos (ECAPGL) en la valva externa de la membrana externa. Las ECA cíclicas libres (ECACYC), formadas por cuatro unidades, se encuentran en el periplasma.

a Síntesis de precursores de azúcares de nucleótidos de ECA. b Ensamblaje de la subunidad ECA unida al transportador lipídico undecaprenilo. c Polimerización y transporte de ECA a la superficie celular. d Síntesis de precursores de azúcares de nucleótidos de LPS centrales. e Montaje del núcleo LPS. f Transporte de LPS a la superficie celular. Abreviaturas: vehículo lipídico de undecaprenilo C55; Membrana interna IM; membrana exterior OM; Fosfato P.

Ninguno de los tres polímeros de ECA fue esencial en la condición −CRO ya que se detectaron inserciones de transposones en genes que codifican enzimas involucradas en la síntesis de precursores de nucleótidos de azúcar (Fig. 5a) y para el ensamblaje de la subunidad de trisacárido ligada a C55 (Fig. 5b). Por el contrario, la mayoría de las enzimas fueron esenciales en la condición +CRO, lo que indica que al menos uno de los tres polímeros de ECA fue esencial para la resistencia (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2). La síntesis de ECALPS y ECACYC fue prescindible para la resistencia, ya que la eliminación de los genes que codifican las ligasas WaaL y WzzE, solas o en combinación, fue prescindible para el crecimiento en presencia de ceftriaxona (Fig. 5c; Fig. Suplementaria S6b). El fenotipo del doble mutante indica la ausencia de redundancia entre ECALPS y ECACYC para la resistencia a ceftriaxona. Por eliminación, estos resultados indican que la síntesis de ECAPGL es esencial para la resistencia, aunque esto no se pudo establecer directamente ya que aún no se ha identificado la polimerasa correspondiente.

Se sabe que el lípido A, sustituido por dos residuos de 3-desoxi-d-mano-octulosonato, es la fracción mínima de LPS necesaria para el crecimiento de E. coli45. En consecuencia, la mayoría de las enzimas involucradas en su síntesis y transporte a la membrana externa fueron esenciales en las condiciones −CRO y + CRO (Fig. 5d-f). Enzimas posteriores, responsables de la síntesis de la subunidad ADP-l-glicero-d-mano-heptosa (RpiA, Rpe, GmhA, HldE, GmhB y HldD), la adición de una d-mano-heptosa a la cadena de sacárido ( WaaC), y la fosforilación de este residuo (WaaP), fueron esenciales sólo en la condición +CRO. Las adiciones de un segundo residuo de d-mano-heptosa (WaaF) y d-glucosa (WaaG) también fueron esenciales para la resistencia (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2). Las enzimas que catalizan los tres pasos posteriores en el ensamblaje del núcleo externo (WaaQ, B y R) fueron necesarias para un crecimiento óptimo en la condición +CRO. Solo tres enzimas de la vía (WaaY, J y U) fueron completamente prescindibles tanto en las condiciones −CRO como +CRO. Estos resultados indican que el crecimiento en presencia de ceftriaxona no fue compatible con una síntesis incompleta de LPS.

Los ensayos puntuales revelaron que el crecimiento en la condición +CRO se asociaba con un fenotipo mucoide, un fenotipo que se sabe que resulta de la sobreproducción de ácidos colánicos por parte de las células estresadas. Esta observación plantea la posibilidad formal de que la esencialidad de los azúcares centrales ldcA, dapF, ECAPGL y LPS en la condición +CRO (arriba) podría depender de la sobreproducción de ácidos colánicos por parte de bacterias expuestas a ceftriaxona. Este no fue el caso ya que ldcA, dapF, wecA y waaC siguieron siendo esenciales en las cepas ΔwcaJ deficientes en la síntesis de ácido colánico (Figura complementaria S6c).

El genoma de E. coli codifica seis miembros de la familia de proteínas LDT (Figura complementaria S1). YcbB e YnhG catalizan la formación de enlaces cruzados 3 → 3, mientras que ErfK, YbiS e YcfS son responsables de unir covalentemente la lipoproteína de Braun (Lpp) a PG10,11. La enzima restante, YafK, hidroliza el enlace Lpp-PG formado por ErfK, YbiS e YcfS, liberando así la lipoproteína46,47. El análisis Tn-seq mostró que la lipoproteína de Braun es prescindible para el crecimiento tanto en condiciones −CRO como +CRO. Los análisis de la estructura de PG revelaron que el crecimiento en presencia de ceftriaxona redujo drásticamente el anclaje de la lipoproteína de Braun a PG (Figura complementaria S7). Los análisis de transferencia Western mostraron que la síntesis de Lpp no ​​se redujo en la condición + CRO (Figura complementaria S7g). Por lo tanto, la ceftriaxona puede inhibir la reacción de anclaje catalizada por las LDT (Figura complementaria S1), pero es poco probable que esta inhibición sea directa ya que las LDT no son inhibidas eficazmente por los β-lactámicos, excepto los que pertenecen a la clase de los carbapenémicos23,24.

Cualquier hipótesis sobre el modo de inhibición del anclaje de Lpp a PG por parte de β-lactámicos debe tener en cuenta el hecho de que las LDT para el entrecruzamiento de PG (YcbB e YnhG) y para el anclaje de Lpp (ErfK, YbiS e YcfS) interactúan con los mismos. sustrato donante, un tallo donante de tetrapéptido, en el primer paso catalítico común a los dos tipos de reacciones de 1,d-transpeptidación (Figuras complementarias S1b, S1c)12. En el segundo paso, las acilo enzimas resultantes reaccionan con un tallo de peptidoglicano para formar 3 → 3 enlaces cruzados o con Lpp para unir covalentemente la lipoproteína a la PG. El sustrato común del primer paso de las reacciones de transpeptidación implica que la competencia de las LDT por el mismo donante de tetrapéptido, como se propuso anteriormente47, puede contribuir a limitar el anclaje de la lipoproteína de Braun a la PG. Sin embargo, esto parece poco probable en el contexto de la resistencia a la ceftriaxona mediada por YcbB, ya que la alta proporción de enlaces cruzados 3 → 3 en la condición + CRO (40%) no fue perjudicial para el anclaje de Lpp (Figura complementaria S7). Por tanto, la alteración del anclaje de Lpp en presencia de ceftriaxona puede deberse a otro efecto inhibidor indirecto de la ceftriaxona sobre la actividad de ErfK, YbiS e YcfS, como la formación de su sustrato tetrapeptídico por una enzima asociada o la estimulación de la liberación de la lipoproteína por YafK.

Habiendo evaluado el papel de los componentes de la membrana externa sobre la integridad de la membrana externa en presencia de ceftriaxona, nuestro siguiente objetivo fue determinar su funcionalidad como barrera de permeabilidad. En ausencia de inductores de ycbB y relA ', se detectó la hidrólisis del rojo de clorofenol-β-d-galactopiranósido (CPRG) por la β-galactosidasa citoplasmática LacZ en un anillo estrecho en el perímetro de la zona de inhibición de ceftriaxona (Fig. 6a) . Por lo tanto, la exposición a concentraciones subinhibitorias cercanas a la concentración inhibidora mínima (CMI) del fármaco resultó en un aumento de la permeabilidad ya que no existe un transportador específico para CPRG. Tras la inducción de ycbB y relA', se detectó actividad LacZ en una zona grande, lo que demuestra que la ceftriaxona aumentó la permeabilidad en concentraciones mucho más bajas que la CIM de esa cepa. El crecimiento en presencia de ceftriaxona sensibilizó a las bacterias al dodecilsulfato de sodio (SDS), lo que resultó en una reducción> 40 veces mayor de la MIC del detergente (Fig. 6b). El crecimiento en presencia de ceftriaxona también aumentó la susceptibilidad a la vancomicina, moenomicina, bacitracina y eritromicina, que se sabe que penetran mal la membrana externa de las bacterias gramnegativas (Fig. 6c). En conjunto, estos datos indican que la derivación de las PBP por parte de YcbB se asoció con la permeabilización de la membrana externa en presencia de ceftriaxona. Esto implica que el modo de acción de los β-lactámicos puede implicar un circuito positivo en el que la unión de los fármacos a sus objetivos promueve el acceso de los fármacos al periplasma. El daño a la membrana externa mediado por especies reactivas de oxígeno (ROS) puede estar involucrado en este proceso, ya que un ensayo colorimétrico detectó un aumento de la peroxidación lipídica (Figura complementaria S7h).

a Hidrólisis de CPRG cromogénico a 20 µg/ml mediante LacZ63 citoplásmico. Los discos se cargaron con 30 µg de ceftriaxona. b Eficiencia del revestimiento en presencia de SDS. El crecimiento se probó en presencia de ceftriaxona a 8 µg/ml (+ceftriaxona) o en ausencia del fármaco (−ceftriaxona) en placas de agar BHI suplementadas con IPTG 40 µM y L-arabinosa al 1% para la inducción de ycbB y relA'. , respectivamente. c Diámetros de inhibición de fármacos que no penetran la membrana externa de E. coli de tipo salvaje. Los valores son la mediana de tres repeticiones biológicas. d Cascada de eventos que conducen a la muerte de las células bacterianas debido a la inactivación de las PBP por los β-lactámicos. e Rescate de la inactivación de PBP por la YcbB l,d-transpeptidasa. Abreviaturas: membrana interna IM; membrana exterior OM; lipoproteína Lpp Braun; Proteínas de la membrana externa OMP. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los objetivos de los β-lactámicos y el mecanismo de su inactivación se conocen desde hace décadas y, sin embargo, aún no se comprende bien la cascada de eventos que conducen a la muerte de las células bacterianas. El modelo más reciente (Fig. 6d) propone que la inactivación de las PBP da como resultado la producción de cadenas de glucano no entrecruzadas en el periplasma y su posterior escisión por enzimas líticas19,21. La demanda anabólica generada por este ciclo inútil de síntesis y degradación de PG genera alteraciones en el metabolismo central del carbono, la síntesis de proteínas y la utilización de ATP que conducen a la producción de ROS que dañan las biomoléculas, incluidos el ADN, el ARN, las proteínas y los lípidos. El estrés oxidativo resultante contribuye a la muerte celular18,48.

El rescate de la inactivación de PBP por YcbB implica, en su sentido más simple, evitar la actividad de entrecruzamiento de las PBP mediante la sustitución de entrecruzamientos 4 → 3 por 3 → 3 (Fig. 1). Sin embargo, nuestro análisis muestra que la resistencia a los β-lactámicos es significativamente más compleja ya que los efectos tóxicos de la inactivación de las PBP persistieron a pesar de que YcbB eludió su actividad d, d-transpeptidasa. De acuerdo, se detectó un aumento de la peroxidación lipídica en la condición + CRO (Figura complementaria S7h). Los genes identificados como selectivamente esenciales en la condición + CRO (Fig. 2; Archivo de datos complementarios 1b) revelaron la complejidad de las funciones que se movilizan para mitigar estos efectos tóxicos (Fig. 6e).

Anteriormente se demostró que el desacoplamiento de la transglicosilación mediada por RodA de la transpeptidación mediada por PBP2 tras la inactivación de esta PBP por β-lactámicos tiene efectos opuestos sobre la viabilidad de bacterias susceptibles y resistentes. En bacterias susceptibles, la acumulación de cadenas de glucano no reticuladas después de la inactivación de PBP2 por β-lactámicos es perjudicial y su degradación por la transglicosilasa lítica SltY contribuye a la supervivencia celular21. Por el contrario, la inactivación de SltY favorece la resistencia mediada por YcbB a las β-lactámicas, con hebras de glicano no reticuladas formadas por el complejo de elongasoma que sirven como sustratos adecuados para el ensamblaje de un polímero de PG funcional. Los experimentos de etiquetado por pulsos indicaron que YcbB apoyó la polimerización de PG a través de un mecanismo de dos pasos que involucra (i) el ensamblaje de 3 → 3 cadenas de glicano reticuladas seguido de (ii) la inserción del polímero neosintetizado resultante en el PG49 existente. En el presente trabajo, proporcionamos evidencia directa de que este modo de polimerización de peptidoglicano requiere un elongasoma funcional, que respalde la polimerización de la cadena de glicano mediante RodA catalíticamente activo (Fig. 3).

El reciclaje de PG se estimula en la condición +CRO49. Esto implica que el rescate de PBP por parte de YcbB reduce pero no elimina la alta demanda anabólica necesaria para alimentar la vía de ensamblaje de PG en presencia del fármaco. Aquí mostramos que la reducción del flujo metabólico de precursores en la vía de ensamblaje de PG no es compatible con la resistencia a los β-lactámicos mediada por YcbB. Se observó que este era el caso de las eliminaciones de dapF o ldcA, que condujeron a la síntesis de precursores aberrantes que contenían 1, 1-DAP o un tallo tetrapeptídico, respectivamente (Fig. 4a). Este también fue el caso de la inactivación de genes que codifican las enzimas de síntesis de ácido colánico que condujeron al secuestro del portador de lípidos undecaprenilo utilizado de manera competitiva para la síntesis de PG (Fig. 4b-d). El exceso residual en la demanda anabólica también puede tener consecuencias no directamente relacionadas con la eficacia de la síntesis de PG. De hecho, una demanda anabólica elevada implica que la producción de ROS sigue siendo elevada. La defensa exitosa contra el estrés oxidativo resultante puede explicar las funciones selectivamente esenciales de los reguladores, chaperonas y enzimas involucradas en la reparación de macromoléculas (Fig. 2e; Archivo de datos complementarios 1b).

Sorprendentemente, encontramos que la resistencia también dependía de ECAPGL (Fig. 5a), LPS que contiene un azúcar central completo (Fig. 5b-d), de componentes del sistema Tol-Pal (Fig. 3a) y de proteínas de la membrana externa, incluidas OmpA y OmpC (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2). Los análisis de morfología bacteriana mostraron recientemente que la membrana externa contribuye directamente a las propiedades mecánicas de la envoltura celular, un papel históricamente atribuido únicamente a la capa PG50,51. Sorprendentemente, los componentes estabilizadores esenciales para la rigidez de la membrana externa identificados en uno de estos informes anteriores50 incluían LPS con un núcleo completo de azúcar, el sistema Tol-Pal y OmpA, también identificado aquí como esencial para la resistencia a la ceftriaxona mediada por YcbB. Por lo tanto, el ensamblaje de una envoltura funcional en presencia de ceftriaxona requirió tanto la derivación de la actividad d,d-transpeptidasa de las PBP por la actividad l,d-transpeptidasa de YcbB como la inserción de polímeros críticos en la membrana externa.

En conclusión, el rescate de PBP por parte de YcbB, junto con una prueba de Tn-seq de todo el genoma, reveló dos impactos inesperados de los β-lactámicos. Primero, la exposición a ceftriaxona impidió el anclaje mediado por l, d-transpeptidasa de la lipoproteína de Braun a PG (Figura complementaria S7). En segundo lugar, la exposición a ceftriaxona aumentó la permeabilidad de la membrana externa (Fig. 6). Este último efecto implica que la penetración autopromocionada a través de la membrana externa es una faceta del modo de acción de los β-lactámicos no reconocida previamente. Además, nuestros datos muestran que el ciclo inútil inducido por β-lactámicos solo era sostenible si la eficacia de la vía de ensamblaje de peptidoglicanos no se veía comprometida por pasos biosintéticos ineficaces o por la competencia con el ensamblaje de otros polímeros que dependen del transportador lipídico común de undecaprenilo. El PG reticulado por YcbB era funcional, aunque la integridad de la envoltura celular dependía en gran medida de los polímeros de la membrana externa que de otro modo serían prescindibles para el crecimiento. Por lo tanto, la identificación de los genes implicados en el rescate de PBP por parte de YcbB proporcionó una prueba positiva para identificar respuestas bacterianas que previenen la destrucción bacteriana por parte de los β-lactámicos. Por el contrario, los análisis metabólicos restringidos a bacterias susceptibles son insensibles a las diferencias entre las perturbaciones específicas de los antibacterianos y la multitud de efectos secundarios relacionados con la muerte celular19. En consecuencia, nuestro análisis proporciona evidencia convincente de que la membrana externa, más allá de su conocido papel como barrera de permeabilidad52, es un actor clave en el modo de acción de los β-lactámicos y en la resistencia a los β-lactámicos mediada por la L,D-transpeptidasa. como se encontró previamente para la tolerancia a estos medicamentos en varias especies bacterianas53,54,55,56. A su vez, nuestro análisis identifica posibles objetivos procesables para aumentar la eficacia de los β-lactámicos contra las bacterias resistentes.

Las características y el origen de los plásmidos y las cepas utilizadas en el estudio se enumeran en la Tabla complementaria S1. Las bacterias se cultivaron a 37 °C en agar o caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI; Difco) con aireación (agitación a 180 rpm). Se usó kanamicina a 50 µg/ml para la selección de transductantes que portaban el casete KmR obtenido de la colección Keio. Los medios de crecimiento se suplementaron sistémicamente con fármacos para contrarrestar la pérdida de plásmido: 10 µg/ml de tetraciclina para el plásmido pKT2, 20 µg/ml de cloranfenicol para pKT8, 25 µg/ml de zeocina para pHV30 y derivados. La inducción de los promotores Ptrc, ParaBAD y PrhaBAD se realizó con isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG, 40 µM), l-arabinosa (1%) y l-ramnosa (0,2%), respectivamente. Los plásmidos construidos en este estudio se obtuvieron utilizando el método de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi (New England Biolabs), a menos que se especifique lo contrario. Las eliminaciones de genes específicos se obtuvieron mediante transducción P1 del casete KmR de mutantes seleccionados de la colección Keio57,58. Para múltiples eliminaciones de genes, el casete KmR fue eliminado mediante la recombinasa FLT codificada por el plásmido pCP20.

Se cultivó una colonia fresca de Escherichia coli BW25113 ΔrelA pKT2(ycbB) pKT8(relA') en 10 ml de caldo BHI suplementado con 10 µg/ml de tetraciclina y 20 µg/ml de cloranfenicol. A una densidad óptica a 600 nm (OD600 nm) de ca. 0,8, las células se recogieron mediante centrifugación y se lavaron cuatro veces con 10 ml de H2O a 4 °C. Se realizaron múltiples electroporaciones (ver más abajo) usando 100 µl de células electrocompetentes y 1 µl de transposoma EZ-Tn5 (Lucigen). Para cada electroporación, las células transformadas se incubaron a 37 °C durante 1 h en 2 ml de caldo BHI suplementado con 10 µg/ml de tetraciclina y 20 µg/ml de cloranfenicol. Las células se sembraron en 20 placas de agar BHI (100 µl por placa) suplementadas con 50 µg/ml de kanamicina, 40 µM de IPTG y 1% de l-arabinosa en ausencia (condición -CRO) o presencia (condición +CRO) de 8 µg. /ml de ceftriaxona. Las placas se incubaron a 37 °C durante 16 h (condición -CRO) o 24 h (condición +CRO). Las células se recuperaron de conjuntos de 20 placas (correspondientes a la misma electroporación) en dos pasos raspando con 4 ml de caldo BHI que contenía 20% de glicerol seguido de un lavado adicional de las placas con 4 ml del mismo medio. Las suspensiones bacterianas obtenidas para cada electroporación se mantuvieron a -80 °C. Para la condición −CRO, se obtuvo un total de 810.000 UFC en 7 electroporaciones. Para la condición +CRO, se obtuvo un total de 260.000 UFC en 10 electroporaciones.

Para la extracción de ADN, se combinaron 10 µl de las suspensiones bacterianas obtenidas en las electroporaciones 7 (condición -CRO) o 10 (condición +CRO). La extracción de ADN se realizó con el kit de purificación de ADN Wizard Genomic (Promega) por duplicado para obtener repeticiones técnicas.

La preparación de las bibliotecas de ADN y la secuenciación de Illumina fueron realizadas por la empresa Viroscan3D y la plataforma ProfileXpert de la Universidad de Lyon 1. Brevemente, se fragmentó el ADN (aproximadamente 300 pb) y se conectaron adaptadores P5 Illumina al ADN fragmentado. Los fragmentos de unión en ambos lados de EZ-Tn5 se amplificaron utilizando el cebador P5 Illumina estándar en asociación con el cebador de hibridación Tn5 HV1 o HV2 que lleva el adaptador P7 Illumina en el extremo 5 '(Tabla complementaria S1). Los índices fueron llevados por los cebadores Tn izquierdo o Tn derecho. La secuenciación de Illumina se realizó en un NextSeq Mid Output de 150 pb (extremo emparejado: 40-110). La demultiplexación y el recorte de las lecturas se realizaron antes de la alineación con el genoma de referencia de E. coli BW25113 (número de acceso del NCBI: CP009273).

El análisis se realizó con el paquete Python (v.3.7) TRANSIT (v.3.0+)59. El componente TPP se utilizó para procesar lecturas experimentales sin procesar y generar archivos WIG para análisis posteriores. Las lecturas de extremos emparejados de Illumina con sitios de inserción EZ-Tn5 se identificaron seleccionando primero aquellos con la secuencia final del transposón 'TAAGAGACAG' esperada entre los nucleótidos 25 y 50 de cada lectura. En todos los casos se utilizó la secuencia inversa de 110 pb (cebador de secuenciación Adapter P7) ya que contenía tanto secuencias EZ-Tn5 como genómicas. Luego, las lecturas de EZ-Tn5 se asignaron a la secuencia de referencia BW25113 de E. coli utilizando BWA (v.0.7.17)60. Para cada experimento se generaron archivos WIG combinados correspondientes a las uniones izquierda y derecha. Los eventos de inserción de transposones se asignaron a genes/marcos de lectura abiertos específicos utilizando el archivo GFF3 GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/) correspondiente a la secuencia genómica FASTA. La normalización del número de inserciones por ORF/gen se realizó mediante lecturas totales recortadas (TTR): recuentos de lecturas totales normalizados después de recortar el 5% superior e inferior de los recuentos de lecturas. Se calcularon los recuentos medios de inserción para cada condición experimental: media de las uniones izquierda y derecha de cada uno de los dos experimentos.

Los fragmentos de unión se alinearon con el genoma de referencia de E. coli BW25113 y los genes esenciales se llamaron utilizando el algoritmo Tn5Gaps de la tubería TRANSIT (archivo de datos complementarios 1a)59. El conjunto de genes selectivamente esenciales en la condición +CRO se construyó mediante: (1) Identificación de genes esenciales en las dos réplicas de +CRO y no esenciales en las dos réplicas de −CRO (subconjunto 1). (2) Agregar genes con una discrepancia entre duplicados técnicos, por ejemplo, marcados como no esenciales en un conjunto de datos +CRO o esenciales en un conjunto de datos −CRO (subconjunto 2). (3) Se calcularon lecturas promedio por gen para identificar inserciones de transposones que están significativamente (valor de p <0,05) subrepresentadas en la condición +CRO (Archivo de datos complementarios 1a). Se eliminaron los genes de los subconjuntos 1 y 2 que produjeron un valor de p > 0,05 o un cambio < 4. El conjunto resultante de 179 genes figura en el Archivo de datos complementarios 1b. Para las vías o grupos de genes que contienen genes selectivamente esenciales en la condición +CRO, también consideramos genes no esenciales que muestran un número significativamente reducido de inserciones en la condición +CRO (p <0,05). Se consideró que estos genes incurrían en un coste de aptitud física.

Las secuencias guía de 20 nucleótidos dirigidas a mrdA (GTCTACAGTTAAACCCTATG) y rodA (GGTGGCTGCACAGCCTGACC) se introdujeron de forma independiente en el plásmido pTargetF61 mediante amplificación por PCR invertida utilizando los cebadores HV3 y HV4 o HV5 y HV6 (Tabla complementaria S1) para generar pTargetF-mrdA y pTargetF-rodA. , respectivamente. Brevemente, pTargetF se amplificó mediante PCR con ADN polimerasa Phusion (Thermo Scientific), los productos de la PCR se digirieron con la enzima de restricción DpnI (Thermo Scientific) y se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Los productos de PCR purificados se fosforilaron y ligaron con la polinucleótido quinasa T4 y la ADN ligasa T4 (Thermo Scientific) en una reacción en un solo recipiente, y los plásmidos pTargetF-mrdA y pTargetF-rodA resultantes se introdujeron en E. coli TOP10 mediante electroporación.

GeneCust sintetizó los ADN donantes mrdA S330A, mrdA S330C, rodA D159A, rodA D159N, ΔmrdA y ΔrodA y los clonó en pUC57. Los ADN de donante utilizados para introducir mutaciones puntuales corresponden a la secuencia de mrdA o rodA con mutación sin sentido en el codón de interés y mutaciones silenciosas en la secuencia correspondiente a los 20 nucleótidos utilizados para guiar a Cas9 en la copia cromosómica del gen (para evitar posteriores escisión por Cas9 después del intercambio alélico). Los ADN donantes utilizados para introducir deleciones corresponden a las secuencias de 100 pb en sentido ascendente, los primeros seis codones, los últimos ocho codones y las secuencias de 100 pb en sentido descendente de mrdA o rodA. Los ADN del donante se amplificaron de forma independiente mediante PCR con ADN polimerasa Phusion (Thermo Scientific) y los cebadores HV7 a HV14 que se muestran en la Tabla complementaria S1. Los productos de la PCR se digirieron con la enzima de restricción DpnI (Thermo Scientific) y se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa.

Método adaptado de Jiang Y. et al.61. Se cultivó una colonia fresca de E. coli BW25113 ΔrelA pKT8(relA') pCas a 30 °C con agitación en 10 ml de caldo BHI suplementado con 1% de l-arabinosa para inducir la expresión tanto de relA' como del sistema λ Red, y con 20 µg/ml de cloranfenicol y 50 µg/ml de kanamicina para contrarrestar la pérdida de los plásmidos. A una OD600nm de ca. 0,8, las células se recogieron mediante centrifugación y se lavaron cuatro veces con 10 ml de H2O a 4 °C. Las bacterias se sometieron a electroporación con el plásmido pTargetF-mrdA y el ADN del donante mrdA S330A, mrdA S330C o ∆mrdA, o con el plásmido pTargetF-rodA y el ADN del donante rodA D159A, rodA D159N o ∆rodA con una proporción molecular de 1 plásmido por 5000 ADN del donante. moléculas. Las células transformadas se incubaron a 30 °C durante 2 h en 1 ml de caldo BHI suplementado con 1% de l-arabinosa, 20 µg/ml de cloranfenicol y 50 µg/ml de kanamicina. Las bacterias se sembraron en agar BHI suplementado con 1% de l-arabinosa, 50 µg/ml de kanamicina y 120 µg/ml de espectinomicina y se incubaron a 30 °C durante 24 h. Para eliminar pTargetF-mrdA o pTargetF-rodA, se aislaron transformantes en el mismo medio suplementado adicionalmente con IPTG 500 µM para la inducción del ARNsg codificado por pCas dirigido al plásmido pTargetF y se incubaron a 30 °C durante 24 h. Las deleciones cromosómicas o mutaciones puntuales se verificaron mediante PCR y secuenciación de Sanger. Para deshacerse del plásmido pCas termosensible, los clones que albergaban las mutaciones esperadas se cultivaron en caldo BHI suplementado con 1% de l-arabinosa e IPTG 500 µM a 37 °C durante 6 h y se aislaron en agar BHI suplementado con 1% de l-arabinosa a 37°C durante 16 h. Los clones aislados se subcultivaron en caldo BHI suplementado con 1% de L-arabinosa a 37 °C durante 6 h y se aislaron en agar BHI suplementado con 1% de L-arabinosa a 37 °C durante 16 h. Se probó la susceptibilidad de los clones aislados a espectinomicina (pérdida de derivados de pTargetF) y kanamicina (pérdida de pCas) para confirmar la pérdida de estos plásmidos.

Las bacterias se cultivaron hasta la fase exponencial tardía, es decir, hasta una DO600 nm de 1,0 a 4,0 (aproximadamente 6 h a 37 °C con agitación vigorosa). La DO600 nm se ajustó a 1,0 y se prepararon diluciones 10 veces (10-1 a 10-5) en caldo BHI. Se colocaron cinco µl de las suspensiones bacterianas resultantes en placas de agar BHI suplementadas con inductores y fármacos como se indica en la leyenda de las figuras. Para el ensayo de difusión en disco, se inocularon 5 µl de la suspensión bacteriana a una DO600 nm de 1,0 en 5 ml de agua. Se inundaron placas de agar BHI con esta última suspensión, se eliminó el exceso de líquido y las placas se mantuvieron a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de agregar los discos de papel que contenían antibióticos. Para el ensayo de rojo de clorofenol-β-d-galactopiranósido (CPRG), se utilizó la cepa BW25113(ycbB, relA') que alberga pHV30bis(lacZ), ya que la cepa BW25113 parental no expresa la copia cromosómica de lacZ. Se tomaron imágenes de las placas o se midieron los diámetros de inhibición después de 16 h (o 24 h para placas que contenían ceftriaxona) de incubación a 37 °C. Los datos mostrados en las figuras son representativos de al menos dos repeticiones biológicas y los diámetros de inhibición medidos son la mediana de tres réplicas biológicas.

Las bacterias se cultivaron en caldo BHI hasta la fase exponencial tardía, es decir, hasta una DO600 nm superior a 1,0 (aproximadamente 6 h a 37 °C con agitación). Diez µl de las suspensiones bacterianas resultantes se sembraron en agar BHI suplementado con inductores (IPTG 40 µM y l-arabinosa al 1%) y fármacos (tetraciclina 10 µg/ml y cloranfenicol 20 µg/ml, o ceftriaxona 8 µg/ml). Para cada réplica, se utilizaron 5 placas de agar BHI para obtener una cantidad suficiente de bacterias. Las placas se incubaron durante 16 h (o 24 h para placas que contenían ceftriaxona) a 37 °C. Las bacterias se recolectaron en dos pasos raspando cada placa con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,2 seguido de un lavado adicional de la placa con 1 ml de PBS. Las bacterias se hirvieron en 0,5 x PBS suplementado con dodecilsulfato de sodio (SDS) al 4% en un volumen final de 20 ml durante 1 h. Los sacculi se recogieron mediante centrifugación (20.000 x g durante 20 min a 20 °C), se lavaron cinco veces con 20 ml de agua, se resuspendieron en 1 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, y se incubaron con 100 µg/ml de pronasa a 37ºC. ºC durante 16 h. Los sacos se lavaron cinco veces con 1 ml de agua, se resuspendieron en 1 ml de fosfato sódico 20 mM, pH 8,0 y se incubaron con 100 µg/ml de tripsina a 37 °C durante 16 h. Los sacos se lavaron cinco veces con 1 ml de agua, se hirvieron durante 5 minutos, se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en 300 µl de agua y se almacenaron a -20 °C.

Se digirieron diez µl de sáculos purificados con lisozima 120 µM en Tris-HCl 40 mM, pH 8,0 a 37 °C durante 16 h. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación a 20.000 x g en una microcentrífuga durante 10 minutos, y la fracción soluble que contenía muropéptidos se redujo con borohidruro de sodio en tampón de borato 125 mM, pH 9,0, durante 1 hora a temperatura ambiente. Se usó ácido fosfórico para ajustar el pH a 4,0. Los muropéptidos se separaron mediante rpHPLC en una columna C18 (Hypersil GOLD aQ; 250 × 4,6 mm; 3 µm, Thermo Scientific) a un caudal de 1 ml/min con un gradiente lineal (0–20%) aplicado entre 10 y 60 min. (tampón A, TFA 0,1%; tampón B, acetonitrilo 99,9%, TFA 0,1%, v/v). Se controló la absorbancia a 205 nm y se recogieron las fracciones, se liofilizaron, se resuspendieron en agua y se analizaron mediante espectrometría de masas. Los espectros de masas se obtuvieron en un espectrómetro de masas de alta resolución Bruker Daltonics maXis (Bremen, Alemania) que funciona en modo positivo (Plataforma analítica del Museo Nacional de Historia Natural, París, Francia). Los datos del espectro de masas se exploraron utilizando mineXpert262.

BW25113(ycbB, relA') se cultivó en las condiciones −CRO y +CRO en placas de agar BHI como se realizó para la preparación de sáculos. Las bacterias se lisaron con SDS al 4% a 96 °C durante 45 min. Los extractos bacterianos crudos se separaron mediante SDS-PAGE. Lpp y RpoA (utilizados como control de carga) se detectaron con anticuerpos policlonales de conejo y ratón proporcionados por JF Collet y C. Beloin, respectivamente. Los anticuerpos primarios se diluyeron a 1/10.000 (v/v). La detección se realizó con anticuerpos anti-conejo (Sigma) y anti-ratón acoplados a peroxidasa (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante del sustrato de transferencia Western PierceTM ECL (Thermo Scientific). Los anticuerpos secundarios se diluyeron a 1/2000 (v/v).

BW25113(ycbB, relA') se cultivó a 37 °C en caldo BHI suplementado con IPTG 40 µM y L-arabinosa al 1% para inducir la expresión de ycbB y relA', respectivamente. A una OD600nm de ca. Se añadió 0,25 de ceftriaxona y se continuó la incubación durante 2 h. Se recogieron bacterias (1 ml), se lisaron y se determinó la concentración de malondialdehído (MDA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de ensayo MDA de peroxidación lipídica (Sigma).

Para el análisis Tn-seq, la reproducibilidad se aborda mediante la correlación de los números de lectura promedio normalizados por CDS para dos réplicas técnicas secuenciadas obtenidas para las condiciones −CRO y +CRO (Fig. 2a, b). El tratamiento estadístico de los datos de Tn-seq se describe bajo el título "Determinación de la esencialidad genética y el costo de aptitud" en la sección "Métodos". Los valores p se obtuvieron a partir de pruebas t de dos colas no apareadas. Para los ensayos de eficiencia del recubrimiento, se realizaron al menos dos repeticiones biológicas (los datos de las figuras provienen de un experimento representativo). Para el análisis de peptidoglicano mediante rpHPLC y espectrometría de masas, se realizaron tres repeticiones biológicas independientes (los datos de las figuras provienen de un experimento representativo). Los datos de las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos son medianas de tres repeticiones biológicas independientes. Para el análisis de transferencia Western, las imágenes son representativas de tres repeticiones biológicas. Las concentraciones de malondialdehído (MDA) son la media y la desviación estándar de tres repeticiones biológicas. Los valores p se obtuvieron a partir de pruebas t de dos colas no apareadas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de Tn-seq generados en este estudio se depositaron en la base de datos Sequence Read Archive (SRA) con el código de acceso PRJNA907050. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Turner, RD, Vollmer, W. & Foster, SJ Diferentes paredes para bastones y bolas: la diversidad de peptidoglicanos. Mol. Microbiol. 91, 862–874 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Sauvage, E., Kerff, F., Terrak, M., Ayala, JA y Charlier, P. Las proteínas de unión a penicilina: estructura y función en la biosíntesis de peptidoglicanos. Microbiol FEMS. Rev. 32, 234–258 (2008).

Artículo CAS Google Scholar

Banzhaf, M. et al. La lipoproteína NlpI de la membrana externa estructura las peptidoglicano hidrolasas dentro de complejos multienzimáticos en Escherichia coli. EMBO J. 39, e102246 (2020).

Singh, SK, SaiSree, L., Amrutha, RN y Reddy, M. Tres mureína endopeptidasas redundantes catalizan un paso de escisión esencial en la síntesis de peptidoglucano de Escherichia coli K12. Mol. Microbiol. 86, 1036-1051 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Vollmer, W. El crecimiento bacteriano requiere peptidoglicano hidrolasas. Mol. Microbiol. 86, 1031-1035 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Egan, AJF, Errington, J. & Vollmer, W. Regulación de la síntesis y remodelación de peptidoglicanos. Nat. Rev. Microbiol. 18, 446–460 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Voedts, H. y col. Papel de las endopeptidasas en la síntesis de peptidoglicanos mediada por enzimas reticulantes alternativas en Escherichia coli. EMBO J. 40, e108126 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Hugonnet, JE et al. Factores esenciales para el entrecruzamiento de peptidoglicanos mediado por l,d-transpeptidasa y la resistencia a β-lactámicos en Escherichia coli. Elife 5, e19469 (2016).

Mainardi, JL y cols. Nuevo mecanismo de resistencia a los betalactámicos debido a la derivación de la transpeptidación dd en Enterococcus faecium. J. Biol. Química. 275, 16490–16496 (2000).

Artículo CAS Google Scholar

Magnet, S., Dubost, L., Marie, A., Arthur, M. & Gutmann, L. Identificación de las l,d-transpeptidasas para el entrecruzamiento de peptidoglicanos en Escherichia coli. J. Bacteriol. 190, 4782–4785 (2008).

Artículo CAS Google Scholar

Imán, S. et al. Identificación de las l,d-transpeptidasas responsables de la unión de la lipoproteína de Braun al peptidoglicano de Escherichia coli. J. Bacteriol. 189, 3927–3931 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Mainardi, JL, Villet, R., Bugg, TD, Mayer, C. y Arthur, M. Evolución de la biosíntesis de peptidoglicanos bajo la presión selectiva de antibióticos en bacterias grampositivas. Microbiol FEMS. Rev. 32, 386–408 (2008).

Artículo CAS Google Scholar

Mainardi, JL y cols. Una nueva enzima reticulante de peptidoglicano para una vía de transpeptidación resistente a β-lactámicos. J. Biol. Química. 280, 38146–38152 (2005).

Artículo CAS Google Scholar

Lavollay, M. y col. El peptidoglicano de Mycobacterium tuberculosis en fase estacionaria contiene predominantemente enlaces cruzados generados por l,d-transpeptidación. J. Bacteriol. 190, 4360–4366 (2008).

Artículo CAS Google Scholar

Hugonnet, JE, Tremblay, LW, Boshoff, HI, Barry, CE y Blanchard, JS El meropenem-clavulanato es eficaz contra Mycobacterium tuberculosis ampliamente resistente a los medicamentos. Ciencia 323, 1215-1218 (2009).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Morè, N. et al. La remodelación de peptidoglicano permite a Escherichia coli sobrevivir a defectos graves de ensamblaje de la membrana externa. MBio 10, e02729-18 (2019).

Izaki, K., Matsuhashi, M. & Strominger, JL Glicopéptido transpeptidasa y d-alanina carboxipeptidasa: reacciones enzimáticas sensibles a la penicilina. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 55, 656–663 (1966).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Hong, Y., Zeng, J., Wang, X., Drlica, K. y Zhao, X. Muerte celular bacteriana postestrés mediada por especies reactivas de oxígeno. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 116, 10064–10071 (2019).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Lobritz, MA y cols. La mayor demanda de energía de los procesos anabólico-catabólicos impulsa la letalidad de los antibióticos β-lactámicos. Química celular. Biol. 29, 276–286.e4 (2022).

Artículo CAS Google Scholar

Lopatkin, AJ y cols. El estado metabólico bacteriano predice con mayor precisión la letalidad de los antibióticos que la tasa de crecimiento. Nat. Microbiol. 4, 2109-2117 (2019).

Artículo de Google Scholar

Cho, H., Uehara, T. & Bernhardt, TG Los antibióticos betalactámicos inducen un mal funcionamiento letal de la maquinaria de síntesis de la pared celular bacteriana. Celda 159, 1300-1311 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Van Opijnen, T. & Camilli, A. Secuenciación de inserción de transposones: una nueva herramienta para el análisis de microorganismos a nivel de sistemas. Nat. Rev. Microbiol. 11, 435–442 (2013).

Artículo de Google Scholar

Triboulet, S. y col. Las características cinéticas de la inactivación de la l,d-transpeptidasa son críticas para la actividad antibacteriana de los β-lactámicos. PLoS One 8, e67831 (2013).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Mainardi, JL y cols. Inhibición inesperada de la peptidoglicano ld-transpeptidasa de Enterococcus faecium por el betalactámico imipenem. J. Biol. Química. 282, 30414–30422 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Ramm, B., Heermann, T. & Schwille, P. El sistema MinCDE de E. coli en la regulación de patrones y gradientes de proteínas. Celúla. Mol. Ciencias de la vida. 76, 4245–4273 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Stouf, M., Meile, JC y Cornet, F. FtsK segrega activamente cromosomas hermanos en Escherichia coli. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 110, 11157–11162 (2013).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Samaluru, H., Saisree, L. y Reddy, M. Papel de SufI (FtsP) en la división celular de Escherichia coli: evidencia de su participación en la estabilización del ensamblaje del divisoma. J. Bacteriol. 189, 8044–8052 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Pichoff, S., Du, S. y Lutkenhaus, J. Interrupción del ensamblaje del divisoma rescatado por la interacción FtsN-FtsA en Escherichia coli. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 115, E6855–E6862 (2018).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Truong, TT, Vettiger, A. & Bernhardt, TG La división celular es antagonizada por la actividad de las peptidoglicano endopeptidasas que promueven el alargamiento celular. Mol. Microbiol. 114, 966–978 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Szczepaniak, J., Press, C. y Kleanthous, C. Las múltiples funciones de Tol-Pal en las bacterias gramnegativas. Microbiol FEMS. Rev. 44, 490–506 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Vinella, D., D'Ari, R. & Bouloc, P. La proteína 2 de unión a penicilina es prescindible en Escherichia coli cuando se induce la síntesis de ppGpp. EMBO J. 11, 1493-1501 (1992).

Artículo CAS Google Scholar

Vinella, D., Joseleau-Petit, D., Thevenet, D., Bouloc, P. & D'Ari, R. La inactivación de la proteína 2 fijadora de penicilina en Escherichia coli da como resultado la inhibición de la división celular, que se alivia con la sobreexpresión de FtsZ. J. Bacteriol. 175, 6704–6710 (1993).

Artículo CAS Google Scholar

Kocaoglu, O. & Carlson, EE Perfil de selectividad de β-lactámicos para proteínas de unión a penicilina en la cepa DC2 de Escherichia coli. Antimicrobiano. Agentes Chemother. 59, 2785–2790 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Rohs, PDA y col. Un papel central de PBP2 en la activación de la polimerización de peptidoglicanos por la maquinaria de elongación de células bacterianas. PLoS Genet. 14, e1007726 (2018).

Artículo de Google Scholar

Özbaykal, G. et al. La transpeptidasa PBP2 gobierna la localización inicial y la actividad de la principal maquinaria de síntesis de la pared celular en E. coli. Elife 9, e50629 (2020).

Liu, X., Biboy, J., Consoli, E., Vollmer, W. & den Blaauwen, T. MreC y MreD equilibran la interacción entre las proteínas elongasomas PBP2 y RodA. PLoS Genet. 16, e1009276 (2020).

Jacobs, C., Huang, LJ, Bartowsky, E., Normark, S. y Park, JT El reciclaje de la pared celular bacteriana proporciona muropéptidos citosólicos como efectores para la inducción de beta-lactamasas. EMBO J. 13, 4684–4694 (1994).

Artículo CAS Google Scholar

Johnson, JW, Fisher, JF y Mobashery, S. Reciclaje de la pared celular bacteriana. Ana. Académico de Nueva York. Ciencia. 1277, 54–75 (2013).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Mengin-Lecreulx, D., Van Heijenoort, J. & Park, JT Identificación del gen mpl que codifica UDP-N-acetilmuramato: L-alanil-gamma-d-glutamil-meso-diaminopimelato ligasa en Escherichia coli y su papel en el reciclaje del peptidoglicano de la pared celular. J. Bacteriol. 178, 5347–5352 (1996).

Artículo CAS Google Scholar

Templin, MF, Ursinus, A. & Höltje, JV Un defecto en el reciclaje de la pared celular desencadena la autólisis durante la fase de crecimiento estacionario de Escherichia coli. EDUCACIÓN J. 18, 4108–4117.

Artículo CAS Google Scholar

Mengin-Lecreulx, D., Michaud, C., Richaud, C., Blanot, D. y van Heijenoort, J. Incorporación de ácido ll-diaminopimélico en peptidoglicano de mutantes de Escherichia coli que carecen de diaminopimelato epimerasa codificada por dapF. J. Bacteriol. 170, 2031-2039 (1988).

Artículo CAS Google Scholar

Catherwood, AC y cols. Control de sustrato y estereoquímico del entrecruzamiento de peptidoglicanos mediante transpeptidación por Escherichia coli PBP1B. Mermelada. Química. Soc. 142, 5034–5048 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Whitfield, C. Biosíntesis y ensamblaje de polisacáridos capsulares en Escherichia coli. Año. Rev. Bioquímica. 75, 39–68 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Rai, AK y Mitchell, AM Antígeno común enterobacteriano: síntesis y función de una molécula enigmática. MBio 11, 1-19 (2020).

Artículo de Google Scholar

Bertani, B. & Ruiz, N. Función y biogénesis de lipopolisacáridos. EcoSal Plus https://doi.org/10.1128/ecosalplus.ESP-0001-2018 (2018).

Bahadur, R., Chodisetti, PK y Reddy, M. Escisión de la lipoproteína Lpp de Braun del peptidoglicano bacteriano mediante un parálogo de l,d-transpeptidasas, LdtF. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 118, e2101989118 (2021).

Winkle, M. y col. Dpaa separa la lipoproteína de Braun del peptidoglicano. MBio 12, e00836-21 (2021).

Dwyer, DJ y col. Los antibióticos inducen alteraciones fisiológicas relacionadas con el redox como parte de su letalidad. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 111, E2100–E2109 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Atze, H. et al. El marcado con isótopos intensos y la espectrometría de masas revelan una remodelación inesperada de la expansión de la pared celular bacteriana en respuesta a los fármacos. Elife 11, e72863 (2022).

Rojas, ER et al. La membrana externa es un elemento de carga esencial en las bacterias Gram-negativas. Naturaleza 559, 617–621 (2018).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Mathelié-Guinlet, M., Asmar, AT, Collet, JF & Dufrêne, YF La lipoproteína Lpp regula las propiedades mecánicas de la envoltura celular de E. coli. Nat. Comunitario. 11, 1-11 (2020).

Artículo de Google Scholar

May, KL & Grabowicz, M. La membrana externa bacteriana es una barrera antibiótica en evolución. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 115, 8852–8854 (2018).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Monahan, LG y cols. La rápida conversión de Pseudomonas aeruginosa a un morfotipo de células esféricas facilita la tolerancia a los carbapenémicos y las penicilinas, pero aumenta la susceptibilidad a los péptidos antimicrobianos. Antimicrobiano. Agentes Chemother. 58, 1956-1962 (2014).

Artículo de Google Scholar

Murtha, AN y cols. La tolerancia alta a los carbapenémicos requiere modificaciones de la membrana externa inducidas por antibióticos. Patógeno PLoS. 18, e1010307 (2022).

Yao, Z., Kahne, D. y Kishony, R. Dinámica morfológica unicelular distinta bajo antibióticos betalactámicos. Mol. Celda 48, 705–712 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Cruz, T. et al. Tolerancia a carbapenémicos mediada por esferoplastos en patógenos gramnegativos. Antimicrobiano. Agentes Chemother. 63, e00756-19 (2019).

Datsenko, KA & Wanner, BL Inactivación en un solo paso de genes cromosómicos en Escherichia coli K-12 utilizando productos de PCR. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 97, 6640–6645 (2000).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Baba, T. y col. Construcción de mutantes knockout de un solo gen en marco de Escherichia coli K-12: la colección Keio. Mol. Sistema. Biol. 2, 2006.0008 (2006).

DeJesus, MA, Ambadipudi, C., Baker, R., Sassetti, C. & Ioerger, TR TRANSIT: una herramienta de software para el análisis Himar1 TnSeq. Computación PLoS. Biol. 11, e1004401 (2015).

ADS del artículo Google Scholar

Li, H. y Durbin, R. Alineación de lectura larga rápida y precisa con la transformada de Burrows-Wheeler. Bioinformática 26, 589–595 (2010).

Artículo de Google Scholar

Jiang, Y. et al. Edición multigénica en el genoma de Escherichia coli mediante el sistema CRISPR-Cas9. Aplica. Reinar. Microbiol. 81, 2506–2514 (2015).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Langella, O. y Rusconi, F. mineXpert2: visualización y exploración en profundidad de datos de espectrometría de masas MS n. Mermelada. Soc. Espectro de masas. 32, 1138-1141 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Paradis-Bleau, C., Kritikos, G., Orlova, K., Typas, A. y Bernhardt, TG Un análisis de todo el genoma para detectar mutantes de biogénesis de la envoltura bacteriana identifica un nuevo factor implicado en el metabolismo de los precursores de la pared celular. PLoS Genet. 10, e1004056 (2014).

Artículo de Google Scholar

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Este trabajo fue apoyado por la Agencia Nacional de Investigación francesa ANR 'RegOPeps' (subvención ANR-19-CE44-0007 a JEH). HV recibió una beca de doctorado de la Sorbonne-Université (ED 515, Complexité du Vivant). Agradecemos a J. Lachuer y J. Bertrand de la plataforma genómica ProfileXpert/Viroscan3D para la secuenciación de inserción de transposones. Agradecemos a A. Marie por la asistencia técnica en la recolección de espectros de masas en la Plateau Technique de Spectrométrie de Masse Bio-Organique del Muséum national d'Histoire Naturelle. Agradecemos a JF Collet y C. Beloin por el generoso obsequio de anticuerpos anti-Lpp y anti-RpoA, respectivamente. Agradecemos a Z. Edoo y F. Rusconi por la lectura crítica del manuscrito.

Estos autores contribuyeron igualmente: Michel Arthur, Jean-Emmanuel Hugonnet.

Centro de Investigación Cordeliers, Universidad de la Sorbona, Inserm, Universidad Paris Cité, F-75006, París, Francia

Henri Voedts, Guennadi Sezonov, Michel Arthur y Jean-Emmanuel Hugonnet

Instituto Pasteur, Universidad Paris Cité, Departamento de Biología Computacional, F-75015, París, Francia

Sean P. Kennedy

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HV: concepción y diseño, adquisición, análisis e interpretación de datos, redacción y revisión del artículo. SK: análisis de datos, redacción y revisión del artículo. GS: redacción y revisión del artículo. MA y JEH: concepción y diseño, análisis e interpretación de datos, redacción y revisión del artículo.

Correspondencia a Michel Arthur o Jean-Emmanuel Hugonnet.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Voedts, H., Kennedy, SP, Sezonov, G. et al. La identificación de todo el genoma de los genes necesarios para el entrecruzamiento alternativo de peptidoglicanos en Escherichia coli reveló impactos inesperados de los β-lactámicos. Nat Comuna 13, 7962 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35528-3

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Recibido: 11 de agosto de 2022

Aceptado: 06 de diciembre de 2022

Publicado: 27 de diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35528-3

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