La geometría de anclaje es un factor importante para determinar la dirección de la cinesina.

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 15417 (2022) Citar este artículo

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Los motores basados en microtúbulos de kinesina-14 tienen una cola N-terminal que une el núcleo catalítico a su carga y generalmente se mueven hacia los extremos negativos de los microtúbulos, mientras que la mayoría de las otras kinesinas tienen una cola C-terminal y se mueven hacia los extremos positivos. La pérdida de secuencias conservadas externas al dominio motor hace que la cinesina-14 cambie a la motilidad del extremo positivo, lo que demuestra que una unión N-terminal es compatible con la motilidad del extremo positivo. Sin embargo, no se ha realizado ningún estudio sistemático sobre el papel de la posición de inserción en la motilidad del extremo negativo. Por lo tanto, examinamos la motilidad de las cinesinas-14 monoméricas que difieren solo en su punto de unión. Encontramos que un punto de unión C-terminal hace que las kinesinas-14 se dirijan hacia el extremo positivo, con una dirección de rotación en forma de sacacorchos de los microtúbulos y un paso en los ensayos de motilidad similares a los de la kinesina-1, lo que sugiere que tanto las kinesinas C-14 como las N -kinesina kinesina-1 comparten una función central catalítica altamente conservada con un sesgo intrínseco del extremo positivo. Por lo tanto, una unión N-terminal es uno de los requisitos para la motilidad del extremo negativo en la cinesina-14.

El movimiento unidireccional de las proteínas motoras cinesinas a lo largo de los microtúbulos es importante en muchos procesos celulares en eucariotas, incluido el transporte de orgánulos y la división celular. En general, la mayoría de las N-kinesinas, como las kinesinas-1 a -10 y -12, en las que el dominio motor está ubicado en la parte N-terminal, se mueven hacia los extremos positivos de los microtúbulos, mientras que algunas C-kinesinas como la kinesina-14, en el que los dominios motores están ubicados en la parte C-terminal, se mueven hacia los extremos menos de los microtúbulos1,2. Sin embargo, no todas las cinesinas tienen una motilidad tan puramente unidireccional y recientemente se ha observado un cambio direccional en algunas cinesinas de levaduras y hongos. Algunas kinesinas-5, N-kinesinas que normalmente están dirigidas hacia el extremo positivo, tienen la notable capacidad de moverse también hacia el extremo negativo de los microtúbulos y cambiar de direccionalidad en diversas condiciones3,4,5,6,7, mientras que algunas kinesinas-5 14 (C-kinesina, que normalmente están dirigidas al extremo negativo) muestran bidireccionalidad dependiente del contexto8,9. A pesar de las direcciones finales opuestas de sus motilidades longitudinales, el núcleo catalítico de las N-kinesinas como la kinesina-1 y las C-kinesinas como la kinesina-14 son notablemente similares en su estructura 3D y secuencias de aminoácidos1,10,11. Además, las cinesinas N, como las cinesinas-112, -213, -314, -515, -616 y -817 y la cinesina C-1418,19 también generan torque, que, junto con su motilidad longitudinal, da como resultado una translocación en forma de sacacorchos de microtúbulos que se deslizan a través de una serie de motores fijados a una superficie. Con la excepción de la kinesina-1 dimérica procesiva, que rastrea con precisión un protofilamento individual en el microtúbulo20, las kinesinas N dirigidas por el extremo positivo impulsan un movimiento de sacacorchos hacia la izquierda del microtúbulo12, mientras que la kinesina-14 dirigida por el extremo negativo Ncd impulsa un movimiento de sacacorchos hacia la derecha18. Esta inversión de la destreza manual en forma de sacacorchos con dirección sugiere que el componente generador de torque lateral de la motilidad de la cinesina es exactamente el mismo en ambos tipos de motor (Figura complementaria 1)12.

En contraste con la similitud de la estructura y función de su núcleo catalítico, la kinesina-1 y la kinesina-14 tienen sus propias regiones únicas adyacentes a los extremos C y N de su núcleo catalítico (Fig. 1a y Fig. Suplementaria 2a,b). ). En la cinesina-1, una región C-terminal de ~ 15 aminoácidos llamada conector de cuello, que se extiende desde la hélice α6 en el núcleo catalítico, sufre cambios conformacionales inducidos por cambios en el estado de los nucleótidos de la cinesina21,22. Se cree que la conformación de acoplamiento de este conector de cuello sobre el núcleo catalítico es el principal evento generador de fuerza para las N-kinesinas. Recientemente, se ha dado a entender que una hebra β N-terminal llamada hebra de cubierta que sobresale del núcleo motor de cinesina-1 interactúa con el conector del cuello formando un "haz de cubierta-cuello", que modula la generación de fuerza a lo largo de los microtúbulos. longitudinal23,24 y ejes laterales cortos25. Sin embargo, el mecanismo de generación de fuerza de acoplamiento del conector del cuello no se conserva en todas las N-kinesinas, ya que algunas N-kinesinas, como las cinesinas-6 y -10, carecen de regiones típicas del conector del cuello26,27. A diferencia de las N-cinesinas, las cinesinas C-14 poseen una estructura de hélice α única llamada hélice de cuello unida directamente al extremo N de la hoja β1 en el núcleo catalítico que está altamente conservada en todas las cinesinas. -14 miembros28. Se ha planteado la hipótesis de que una oscilación rotacional de la hélice del cuello es responsable de la generación de fuerza y de la direccionalidad del extremo negativo en las cinesinas-14, equivalente a la oscilación del brazo de palanca propuesta para las proteínas motoras de miosina basadas en actina29, aunque el estado de nucleótidos en el que se encuentra la Los cambios de hélice del cuello siguen siendo controvertidos19,30,31,32. Además, la cinesina-14 también contiene una región corta C-terminal llamada imitador del cuello que sobresale de la hélice α6. Aunque el imitador del cuello tiene poca similitud con el conector del cuello de las N-kinesinas a nivel de aminoácidos, contiene varios aminoácidos básicos y uno hidrofóbico que están altamente conservados en la kinesina-14s33. El imitador del cuello no se detectó en estructuras cristalográficas o de microscopía crioelectrónica de kinesina-14 de tipo salvaje Drosophila melanogaster Ncd30,34 o Saccharomyces cerevisiae Kar335, pero se detectó en la estructura del miembro de kinesina-14 KCBP (unión de calmodulina similar a kinesina). proteína), donde la región C-terminal que incluye el imitador del cuello se acopla al núcleo catalítico de la misma manera que el conector del cuello en las N-kinesinas36. En Ncd con la mutación única T436S, también se demostró que los primeros tres residuos de la región imitadora del cuello se acoplaban al núcleo catalítico31. Los ensayos bioquímicos y de motilidad también indican que el imitador del cuello de Ncd puede regular la afinidad de unión de Ncd a los microtúbulos y la motilidad dirigida al extremo negativo33. Estos estudios sugieren que la región C-terminal que imita el cuello en las cinesinas C también puede estar involucrada en la generación de fuerza para la motilidad dirigida hacia el extremo negativo de manera similar a la unión del cuello de las cinesinas N para la motilidad dirigida hacia el extremo positivo. .

Observación de la direccionalidad de la cinesina-14 monomérica ligada a N o C. (a) La estructura 3D de Ncd (PDB: 5W3D) 43 y kinesin-1 (PDB: 4HNA) 44. El núcleo catalítico (Ncd, naranja; cinesina-1, cian) tiene una alta homología estructural entre las cinesinas. La hélice del cuello N-terminal de Ncd (amarillo) y la hebra de cubierta de kinesin-1 (azul) tienen poca homología estructural. El imitador de cuello C-terminal de Ncd (rosa) y el conector de cuello de kinesina-1 (púrpura) tienen poca homología estructural. (b) Construcciones monoméricas utilizadas en este estudio. Todas las construcciones (cinesina-14, mutante Ncd y quimera kinesina-1-Ncd) tienen péptido biotinilado (avi-tag) en su extremo N o C. La construcción NcdRan14 tiene una inserción aleatoria de 14 residuos GESGAKQGEKGESG (verde) entre la hélice del cuello y el núcleo catalítico, correspondiente al dimérico ncd-ran12 del informe anterior28. La quimera nKn664 está compuesta por Ncd K325-N348—RnKIF5C I9-K320—Ncd A664-K70038, correspondiente a la quimera dimérica NcdKHC1 del informe anterior37. ( c, d ) Esquema de una cinesina-14 monomérica anclada al sustrato recubierto de estreptavidina a través de su extremo N (c) y C-terminal (d), respectivamente.

Se han utilizado quimeras que fusionan porciones de la cinesina C-14 Ncd con partes de una cinesina-1 para identificar cuáles de las características de la secuencia determinan la direccionalidad de la cinesina. Las regiones Ncd de hélice de cuello y mímica de cuello junto con 5 aminoácidos (AASVN) del núcleo catalítico se fusionaron a los extremos N y C, respectivamente, de un núcleo motor catalítico de N-cinesina-1 con la construcción anclada a través de sus extremo N a la superficie del sustrato (Figuras complementarias 2 y 3). Tanto la versión dimérica NcdKHC137 como la monomérica nKn66438 de la construcción tienen direccionalidad del extremo negativo de los microtúbulos, invirtiendo la polaridad normal del extremo positivo del movimiento de la kinesina-1 (Figuras complementarias 2c, dy 3). Sin embargo, si había mutaciones presentes en la unión N-terminal cuello-hélice-núcleo catalítico (NcdKHC5), la direccionalidad no cambió y el NcdKHC5 retuvo la direccionalidad del extremo positivo de la kinesina-137 (Figuras complementarias 2e y 3). Sablin et al. también encontró que la mutación de los residuos conservados de la hélice del cuello en una construcción dimérica Ncd (ncd-ran12), en la que la hélice del cuello se mutó aleatorizando 12 residuos y el extremo N se ancló a la superficie en un ensayo de motilidad. , era un motor lento dirigido hacia el extremo positivo, que invertía la direccionalidad normal del extremo negativo de Ncd28 (Figuras complementarias 2j y 3). Por lo tanto, tanto la hélice del cuello como su unión al catalizador del motor son factores importantes para determinar la direccionalidad del extremo negativo.

El análisis estructural de una construcción de monómero quimérico dirigido al extremo negativo (nKn664) mostró que los cambios conformacionales dependientes de nucleótidos del imitador del cuello, que se encuentra cerca del grupo interruptor II, y su asociación con la hélice del cuello N-terminal, acoplados Hidrólisis de ATP en el giro rotacional de la hélice del cuello 38 (Figuras complementarias 2d y 3). Sin embargo, nKn669, donde los cinco aminoácidos de la kinesina-14 (AASVN) en el núcleo catalítico y la unión C-terminal del imitador del cuello fueron reemplazados por los de la kinesina-1 (GQRAK), carecía de la interacción del imitador del cuello con la hélice del cuello. —Unión del núcleo catalítico vista en nKn664. En los ensayos de motilidad, la direccionalidad de nKn669 no cambió, de modo que nKn669 retuvo la direccionalidad del extremo positivo de la kinesina-1 (Figuras complementarias 2f y 3). En conjunto, estos resultados sugieren que se requiere el funcionamiento y la interacción adecuados tanto de la hélice del cuello Ncd como del imitador del cuello para revertir la polaridad dirigida por el extremo positivo del movimiento del núcleo catalítico de kinesina-1 para que se dirija hacia el extremo negativo. Además, dado que tanto el mutante dirigido por el extremo positivo (ncd-ran12) como las quimeras (NcdKHC5 y nKn669) carecen de la hebra que cubre el cuello de kinesina-1 y del conector de cuello de kinesina-1, el propio núcleo catalítico de kinesina-1 puede contener más -determinantes de polaridad final como se sugirió anteriormente28,39, al menos en ausencia de determinantes funcionales del extremo negativo.

Otros estudios han demostrado que las quimeras diméricas complementarias de ncd-Nkin40 y NK-141 que contienen la hélice del cuello de Ncd o la hebra de cubierta de kinesina-1 seguida por el núcleo catalítico de Ncd fusionado a parte de α6 de kinesina-1 (GMRAK o K ) más una región de tallo/enlazador de cuello de cinesina-1 C-terminal, ambos se movieron hacia el extremo positivo del microtúbulo, invirtiendo la polaridad del extremo negativo del movimiento Ncd (Figuras complementarias 2g, h y 3). Ambas quimeras se anclaron a la superficie a través de su tallo de cinesina-1 C-terminal en los ensayos de motilidad. Sin embargo, si la quimera dimérica NcdKHC6, que consta de la región del tallo/cuello-hélice de Ncd y la región del núcleo del motor catalítico de Ncd fusionada a parte de α6 de la cinesina-1 (GRRAK) más la región de unión del cuello de la cinesina-1, estuviera anclada a la superficie a través de su hélice de cuello N-terminal, retuvo la polaridad del extremo negativo del movimiento Ncd37 (Figuras complementarias 2i y 3). Esto sugirió que la combinación de parte de α6 de kinesin-1 (GRRAK) y el conector de cuello de kinesin-1 puede sustituir la combinación de parte de α6 de Ncd (AASVN) y el imitador de cuello de Ncd lo suficientemente bien como para generar menos- motilidad dirigida a un extremo. Sin embargo, todavía no está claro si el imitador de cuello Ncd puede sustituir al conector de cuello kinesin-1 lo suficientemente bien como para reemplazarlo con motilidad terminal positiva si el imitador de cuello Ncd se usa para anclar el núcleo catalítico a través de una superficie C-terminal. unión, o si esta es una función específica de la secuencia conservada del conector del cuello. Por lo tanto, la equivalencia funcional del entrelazador de cuello y el imitador de cuello sigue sin estar clara y, en particular, la capacidad del imitador de cuello para actuar como un entrelazador de cuello "efectivo" para apoyar la motilidad dirigida hacia el extremo positivo cuando el imitador de cuello está anclado directamente a la superficie del sustrato nunca ha sido examinado.

La característica estructural más llamativa de la familia de kinesinas-14 de motores dirigidos al extremo negativo es que todos son motores con terminal C, mientras que las kinesinas-1 dirigidas al extremo positivo son terminales N. Además, en los estudios de inversión de dirección que utilizan quimeras, la dirección del extremo negativo solo se observó en construcciones ancladas en el extremo N (véanse las figuras complementarias 2c, d, i y 3 y las referencias 37, 38), mientras que la motilidad del extremo positivo ocurrió en ambos. Construcciones ancladas en los terminales N y C (véanse las figuras complementarias 2e, f, g, h, j y 3 y las referencias 28,37,38,40,41), lo que a veces ha llevado a suponer que la función del anclaje La geometría es obvia. Sin embargo, en estos estudios el efecto de la geometría de anclaje nunca se estudió independientemente de las secuencias que rodean el núcleo del motor catalítico. Por lo tanto, todas las construcciones ancladas en el terminal N con polaridad dirigida al extremo negativo contenían hélice de cuello, mientras que las construcciones ancladas en el terminal C contenían secuencias de enlace de cuello. Observaciones recientes de inversión en algunas cinesinas nativas también han planteado dudas sobre el papel del anclaje en la determinación de la dirección. La motilidad bidireccional de las kinesinas-14 de doble cabeza KlpA9 y Kar38 muestra que el anclaje del extremo N es compatible con la motilidad dirigida tanto al extremo positivo como al negativo en las cinesinas C nativas, mientras que las kinesinas C nativas de doble o cuádruple cabeza La N-kinesina kinesina-5s3,4 puede tener motilidad dirigida tanto hacia el extremo negativo como hacia el positivo, lo que demuestra que otras geometrías de kinesina son potencialmente compatibles con la motilidad del extremo negativo. Para al menos algunas kinesina-5 donde las construcciones diméricas o tetraméricas eran bidireccionales, las construcciones monoméricas solo mostraron una motilidad robusta dirigida hacia el extremo positivo5,42, lo que sugiere un mecanismo de conmutación que requiere al menos dos cabezas de kinesina. La construcción de doble cabeza C-terminal kinesin-14 KlpA contiene un sitio de unión de microtúbulos adicional en el tallo9. La dirección está determinada por el motor y el tallo que se unen al mismo o a diferentes microtúbulos, lo que sugiere una posible relación con la geometría de anclaje, ya que al eliminar el segundo sitio de unión de microtúbulos, el KlpA se dirige solo al extremo negativo. Por lo tanto, el papel de la geometría de anclaje, y específicamente el requisito de que el anclaje N-terminal genere motilidad del extremo negativo, sigue sin estar claro en las kinesinas-14 nativas.

En este estudio, hemos investigado el papel de la geometría de anclaje en la determinación de la dirección nativa de la kinesina-14 de una sola cabeza y la capacidad del imitador del cuello de kinesina-14 para sustituir al conector del cuello en la motilidad dirigida hacia el extremo positivo cuando el cuello- El imitador está anclado al sustrato. Para separar el papel de la geometría de anclaje de otros factores, hemos utilizado construcciones monoméricas para distinguir entre las actividades inherentes a las cabezas individuales del papel de las interacciones relativas de las cabezas en el dímero. Se crearon construcciones mínimas que comprenden solo el núcleo catalítico, la hélice del cuello y el imitador del cuello de tres kinesina-14 diferentes con una etiqueta de afinidad N o C-terminal para anclar la kinesina. Examinamos la dirección del movimiento de deslizamiento y tirabuzón de los microtúbulos en ensayos de motilidad de microtúbulos. Las construcciones monoméricas de kinesina-14 ancladas en el extremo N-terminal estaban dirigidas al extremo negativo como se informó anteriormente30. Sin embargo, cuando las C-cinesina kinesina-14 se unen a una superficie de sustrato a través de su región imitadora del cuello C-terminal, invierten la dirección para volverse más hacia el extremo con un movimiento de sacacorchos hacia la izquierda. La destreza y el paso del sacacorchos de microtúbulos son los mismos que se observan con la motilidad de sacacorchos de microtúbulos impulsada por la kinesina-1 monomérica genuina de N-kinesina y la kinesina-5, lo que indica una fuerte conservación de la actividad central catalítica entre las cinesinas N y C. Estos resultados muestran que, además de las regiones de hélice del cuello y mímica del cuello identificadas previamente37,38, se requiere un accesorio de anclaje N-terminal para generar motilidad dirigida al extremo negativo de los microtúbulos. Además, este efecto ocurre en cinesinas monoméricas, lo que sugiere que el mecanismo no depende de las geometrías de cabeza relativas de los dímeros y explica la configuración conservada de cinesina C de la familia de cinesina-14.

Las proteínas motoras nativas de kinesina-14 comparten una capacidad común para la direccionalidad del extremo negativo de los microtúbulos y una estructura distintiva con la cola de kinesina unida al extremo N del núcleo catalítico conservado a través de una estructura de cuello-hélice, mientras que el extremo C tiene un cuello. -región mímica ubicada donde el conector del cuello une el dominio motor a los dominios del tallo y la cola C-terminal de otras N-kinesinas (Fig. 1a). Aunque la hélice del cuello y la imitación del cuello son necesarias para la motilidad del extremo negativo37,38, el papel del anclaje N-terminal en la determinación de la direccionalidad de los motores de cinesina-14 aún no está claro. Para examinar el papel de la unión del sustrato en la determinación de la direccionalidad, creamos una serie de construcciones que comprenden un dominio motor mínimo de una kinesina-14 con la misma etiqueta de anclaje en su extremo N o C. Para excluir las interacciones de la cabeza motora en construcciones diméricas, dominios motores mínimos de kinesina-14 monomérica de Drosophila melanogaster Ncd, 325–700 aa18; Saccharomyces cerevisiae Kar3, 363–729 aa45; o Aspergillus nidulans KlpA, 398–770 aa9 se fusionaron con un péptido biotinilado (avi-tag)46 en su extremo N (BP-Ncd325, BP-Kar363, BP-KlpA398) o en su extremo C (Ncd325-BP, Kar363 -BP, KlpA398-BP) (Fig. 1b y Fig. complementaria 3). Estas construcciones nos permitieron unir los mismos monómeros de cinesina-14 a un sustrato recubierto de estreptavidina, ya sea a través de su hélice de cuello en el extremo N del dominio motor (Fig. 1c), o mediante el imitador de cuello en el extremo C. (Figura 1d). Con la conexión N-terminal, la hélice del cuello, que se ha propuesto oscilar para crear la fuerza del extremo negativo, está unida a la superficie y puede transmitir cualquier fuerza generada30, mientras que con la conexión C-terminal, la conexión N-terminal. La hélice está libre en solución y no se esperaría que cualquier movimiento oscilante del cuello-hélice ejerza directamente una fuerza sobre el motor.

Primero analizamos la direccionalidad longitudinal de las construcciones monoméricas de kinesina-14 ligadas a N y ligadas a C (Ncd325, Kar363 y KlpA398) utilizando un ensayo de deslizamiento de microtúbulos marcado con polaridad in vitro38,47 (Fig. 2). Los céspedes de construcciones de kinesina-14 Ncd325, Kar363 o KlpA398 ligadas a N impulsaron el deslizamiento de los microtúbulos con los extremos más oscuros hacia adelante, lo que indica una actividad motora dirigida hacia el extremo negativo (Fig. 2b, d, f y Película complementaria 1), que es consistente con informes anteriores9,30,45. Sorprendentemente, encontramos que los céspedes de construcciones de kinesina-14 ligada a C Ncd325, Kar363 o KlpA398 impulsaron el deslizamiento de los microtúbulos con los extremos negativos brillantes hacia adelante, lo que indica una actividad motora dirigida por el extremo positivo, similar a la kinesina-1 (Fig. 2c, e, g y Película complementaria 1), invirtiendo su direccionalidad longitudinal normal dirigida hacia el extremo negativo.

Ensayos de deslizamiento de microtúbulos marcados con polaridad impulsados por cinesinas monoméricas unidas a N o C. ( a ) Esquema del ensayo de deslizamiento de microtúbulos marcados con polaridad in vitro. Las cinesinas de una sola cabeza fusionadas a una etiqueta biotinilada (avi-tag) se anclan a la BSA biotinilada mediante un enlace biotina-estreptavidina. ( b – g ) Quimografías típicas del deslizamiento de microtúbulos marcados con polaridad impulsado por Ncd (b), Kar3 (d), KlpA (f) y monoméricos unidos a N Ncd (c), Kar3 (e), KlpA ( g) se muestran. Las kinesina-14 monoméricas ligadas a N deslizan los microtúbulos con sus extremos positivos apagados hacia adelante, lo que indica actividad motora dirigida hacia el extremo negativo, mientras que las kinesinas-14 monoméricas ligadas a C se deslizan con sus extremos negativos brillantes hacia adelante, lo que indica motor dirigido hacia el extremo positivo. actividad. ( h, i ) Se muestran quimografías típicas del deslizamiento de microtúbulos marcados con polaridad impulsado por el mutante Ncd NcdRan14. Tanto las cinesinas monoméricas unidas a N- (h) como a C- (i) deslizan los microtúbulos con sus extremos negativos brillantes hacia delante, lo que indica actividad motora dirigida hacia el extremo positivo. Los signos más (+) y menos (-) se refieren al extremo positivo y negativo de los microtúbulos, respectivamente.

Para determinar si la configuración del ensayo de deslizamiento de microtúbulos, con las cinesinas estacionarias y ancladas al sustrato de la cámara, influyó en el movimiento de la cinesina, también analizamos la direccionalidad de las construcciones monoméricas de cinesina-14 ligadas a N y C (Ncd325, Kar363 y KlpA398). ) conectando múltiples motores a puntos cuánticos (QD) y permitiendo que los motores y QD se muevan, microtúbulos marcados con polaridad inmovilizados en el sustrato (Fig. 3a). Los QD que transportaban kinesina-14 ligada a N (Ncd325, Kar363 y KlpA398) nuevamente se movieron hacia los extremos negativos de los microtúbulos, mientras que las kinesina-14 ligadas a C (Ncd325) todavía se movieron hacia los extremos positivos (Fig. 3b-d y Tabla 2 y Suplementaria). Película 2). Kar363 y KlpA398 unidos a C no mostraron un movimiento unidireccional estable a lo largo de los microtúbulos, probablemente debido a su procesividad mecánica extremadamente baja. Estos datos indican claramente que la direccionalidad en los monómeros de kinesina-14 no depende de la geometría del ensayo o de las fuerzas particulares que actúan en los ensayos de deslizamiento de microtúbulos, sino que depende de qué extremo del dominio motor de kinesina-14 está unido al sustrato. Para los tres núcleos catalíticos de kinesina-14 probados, el acoplamiento a través de la hélice del cuello N-terminal produce una direccionalidad del extremo negativo como se esperaba, mientras que el acoplamiento a través del imitador del cuello C-terminal invierte la dirección y genera motilidad dirigida al extremo positivo.

Ensayo QD de Ncd325 monomérico unido a N o C. (a) Esquema del ensayo de puntos cuánticos (QD). Los QD recubiertos con estreptavidina, que están unidos a Ncd fusionados con etiqueta avi a través de una etiqueta avi N o C terminal y un enlace biotina-estreptavidina, se mueven sobre microtúbulos marcados con polaridad. ( b, c ) Imágenes secuenciales de QD que se mueven sobre microtúbulos marcados con polaridad. QD-BP-Ncd325 (punta de flecha roja, b) se mueve hacia el extremo menos brillante del microtúbulo y Ncd325-BP-QD (punta de flecha amarilla, c) hacia el extremo más oscuro del microtúbulo. ( d ) Un histograma de velocidades de motilidad de un QD recubierto con Ncd monomérico unido a N (gris) y Ncd monomérico unido a C (negro). Las velocidades medias para QD-BP-Ncd325 y Ncd325-BP-QD son − 37 ± 16 nm s−1 (media ± SD, n = 171) y + 63 ± 20 nm s−1 (media ± SD, n = 248) , respectivamente. Los signos más (+) y menos (-) se refieren al extremo positivo y negativo del microtúbulo.

Nuestros resultados sugieren que el anclaje del dominio motor a través del extremo N es fundamental para la motilidad dirigida al extremo negativo en los motores de kinesina-14. Sablin et al. han informado que un mutante ncd-ran12, donde 12 aminoácidos de la hélice del cuello entre el extremo N del motor y la cola de una construcción dimérica Ncd se reemplazan por 12 aminoácidos aleatorizados, cambia su direccionalidad del extremo negativo al una motilidad lenta dirigida hacia el extremo positivo28. Sin embargo, no estaba claro si esto se debió a cambios en las interacciones de las cabezas del dímero o a cambios en la función de las cabezas individuales. Por ejemplo, los reemplazos de 12 aminoácidos pueden haber permitido que el dominio motor no adherido del Ncd de dos cabezas se inclinara hacia el extremo positivo del microtúbulo, lo que resultó en la direccionalidad del extremo positivo. Por lo tanto, creamos dos construcciones monoméricas similares, NcdRan14, insertando 14 aminoácidos aleatorios adicionales entre la hélice del cuello y el núcleo catalítico de nuestras construcciones monoméricas (Fig. 1b) con la etiqueta avi unida al extremo N o C de cada una. constructo (Fig. 1c, d y Fig. complementaria 3). En los ensayos de motilidad de microtúbulos y QD, tanto el NcdRan14 monomérico ligado a C como el monomérico ligado a N mostraron motilidad dirigida al extremo positivo (Fig. 2h, i y Películas complementarias 1 y 2). Esto demuestra que a pesar de que la construcción todavía estaba anclada al sustrato a través de su extremo N, esto fue insuficiente y que el acoplamiento directo de la hélice del cuello al dominio motor es fundamental para generar la direccionalidad del extremo negativo. En ausencia del acoplamiento preciso cuello-hélice, el monomérico Ncd genera un movimiento lento dirigido hacia el extremo positivo, similar al mutante dimérico correspondiente, ncd-ran1228, y muestra que este efecto es intrínseco a la cabeza monomérica y no depende de la Presencia de la segunda cabeza en el dímero.

La velocidad de 5 nm s-1 del deslizamiento de microtúbulos impulsada por nuestra construcción monomérica Ncd dirigida al extremo negativo (Tabla 1) es similar a la velocidad de 4 nm s-1 reportada previamente para una construcción monomérica Ncd similar30, lo que sugiere que la velocidad de las construcciones ligadas a N en nuestro ensayo no estaban siendo inhibidas por la etiqueta de anclaje utilizada en nuestras construcciones. El ensayo de deslizamiento de microtúbulos (Tabla 1, Fig. 2 y Fig. 4 complementaria) y el ensayo de motilidad QD (Tabla 2, Fig. 3 y Fig. 5 complementaria) también mostraron una tendencia constante con velocidades de kinesina-14 ligada a C 1,5–. 150 veces más rápido en comparación con las velocidades de la kinesina-14 ligada a N. En particular, NcdRan14 ligado a C fue mucho más rápido que NcdRan14 ligado a N en ambos ensayos. Ambas construcciones tienen dominios motores idénticos y direccionalidad con extremos positivos, lo que sugiere que estas diferencias pueden no surgir simplemente de variaciones en la cantidad de motores que funcionan en los equipos vinculados a los QD. Nuestros resultados amplían trabajos anteriores31,33,39,48 al mostrar que el imitador del cuello también puede amplificar más eficientemente los cambios conformacionales sesgados en el extremo positivo que se propone que ocurran en el núcleo catalítico de la kinesina-14, cuando el cuello C-terminal- imita los anclajes del núcleo del motor catalítico al sustrato.

Para aclarar el papel del imitador de cuello de Ncd, examinamos la direccionalidad de una quimera de cinesina-1 Ncd anclada en el terminal C nKn664-BP, que contiene el núcleo catalítico de cinesina-1 con hélice de cuello de Ncd y imitador de cuello (Fig. .1b). Anteriormente habíamos demostrado que BP-nKn664 ligado a N estaba dirigido al extremo negativo38, y ahora encontramos que nKn664-BP ligado a C invirtió esto para producir una direccionalidad del extremo positivo (Tabla 1 y Figura complementaria 4e). La velocidad de deslizamiento de 10 nm s-1 impulsada por nKn664-BP ligado a C fue ~ 50 veces más rápida que la de BP-nKn664 ligado a N, lo que indica que el imitador de cuello Ncd puede reemplazar al vinculador de cuello kinesin-1 en combinación. con el dominio catalítico kinesin-1. En conjunto, estas observaciones sugieren que a pesar de sus diferencias en la secuencia de aminoácidos, el conector de cuello kinesin-1 y el imitador de cuello Ncd son funcionalmente similares. Además, en toda la superfamilia de kinesina, independientemente de la direccionalidad nativa de toda la molécula motora de kinesina, el núcleo catalítico de kinesina en sí tiene una actividad mecánica débil dirigida hacia el extremo positivo de los microtúbulos. Además, con el anclaje apropiado del motor a través del extremo C, la pequeña tendencia dirigida hacia el extremo positivo presente en el núcleo catalítico puede amplificarse eficientemente mediante la corta región imitadora del cuello del extremo C para producir una motilidad rápida.

Además del dímero procesivo de kinesina-120, que rastrea los protofilamentos de los microtúbulos, la mayoría de las kinesinas que se mueven a lo largo del eje longitudinal de los microtúbulos también generan un par que hace que los microtúbulos deslizantes en los ensayos de motilidad giren alrededor de su eje longitudinal. El movimiento en tirabuzón de los microtúbulos resultante se ha observado en construcciones de cinesina-1, -2, -3, -5, -6, -8 y -14. Las cinesinas N dirigidas al extremo positivo causan un sacacorchos a izquierdas12,14,15,16,42,49, mientras que las cinesinas C dirigidas al extremo negativo (cinesina-14, Ncd dimérica) causan un sacacorchos a derechas18,19 , lo que implica una dirección de torsión similar en relación con el dominio catalítico en todas las cinesinas (consulte la Figura 1 complementaria para conocer la definición de lateralidad). Por lo tanto, examinamos la rotación de los microtúbulos causada por nuestras construcciones en ensayos de motilidad de microtúbulos observados utilizando un microscopio de seguimiento óptico prismático tridimensional (tPOT), que puede detectar el movimiento 3D con una precisión de nm15. En ensayos de motilidad que utilizan Ncd325-Gel, Kar363-Gel o KlpA398-Gel kinesin-14, que están anclados a la superficie mediante una fusión de gelsolina C-terminal y tienen motilidad dirigida hacia el extremo positivo (Fig. 4a-c y Película complementaria 3), microtúbulos deslizantes girados con un sacacorchos izquierdo con un paso de ~ 0,3 μm (Fig. 4d-h y Figs. complementarias 6 y 7). Por lo tanto, en las construcciones de kinesina-14 donde la direccionalidad longitudinal ha cambiado de menos a más, la rotación de los microtúbulos también ha cambiado de un movimiento de tirabuzón de derecha a izquierda, consistente con la dirección del torque que permanece fija en relación con la cabeza de kinesina. a pesar de la inversión de la dirección longitudinal. Además, el paso de ~ 0,3 μm del sacacorchos es similar al paso informado para los monómeros kinesinas-1 y -5 dirigidos hacia el extremo positivo15,25. Este resultado es consistente con el dominio motor de cinesina que tiene un componente lateral de movimiento con la misma magnitud y dirección durante la motilidad dirigida tanto en el extremo positivo como en el negativo (Figura complementaria 1). La similitud del tono, a pesar de las diferencias en la velocidad, sugiere un vínculo estrecho entre los cambios conformacionales que generan el movimiento longitudinal y el torque. También sugiere fuertemente que el conector de cuello de las N-kinesinas y el imitador de cuello de las C-kinesinas funcionan de la misma manera para generar los mismos vectores direccionales de fuerzas longitudinales y rotacionales, con la misma relación constante de las dos fuerzas en ambos. casos, resultando en el mismo paso de sacacorchos.

Las trayectorias 3D del movimiento en espiral de los microtúbulos deslizantes impulsados por Ncd ligado a C. (a) Un esquema del ensayo de sacacorchos in vitro durante la medición 3D. El microtúbulo escasamente biotinilado, marcado con Cy5 y con un QD (λ = 525 nm) unido, es un sacacorchos impulsado por un gel Ncd325 ligado a C anclado a la superficie de vidrio recubierta con proteína G (gris) mediante un anticuerpo anti-etiqueta His (púrpura) . (b) Un esquema de la configuración tPOT (no para la venta). La posición z de un QD y la posición x–y se obtienen a partir de un par de imágenes divididas por el prisma. La temperatura en la cámara se mantiene a 25 °C mediante la unidad de control de temperatura combinada. (c) Imágenes secuenciales del QD adherido a microtúbulos observado bajo el microscopio tPOT. La imagen inferior muestra un microtúbulo marcado con Cy5, mientras que las otras muestran un QD adherido al microtúbulo en translocación. Las puntas de flecha sólidas y abiertas indican las imágenes divididas por el prisma del QD unido al microtúbulo, respectivamente (tiempo en segundos). Barra de escala, 2 μm. (d) El gráfico 3D del QD revela la rotación hacia la izquierda del microtúbulo deslizante. La flecha indica el desplazamiento aproximado durante 10 s. (e) Las trayectorias x – y (rojo) y x – z (azul) de los microtúbulos en forma de sacacorchos impulsados por Ncd325-Gel que se muestran en (d). El paso de rotación de los microtúbulos en forma de sacacorchos impulsados por Ncd325-Gel se determinó ajustando la posición x – y del QD con una función sinusoidal (línea negra), lo que arrojó un valor de 0,30 µm. (f) La trayectoria y – z del QD unido al microtúbulo que se muestra en (d). La trayectoria de la primera revolución se muestra con la línea negra y comienza en el cuadrado abierto. La trayectoria muestra la rotación en sentido antihorario del microtúbulo deslizante cuando se mira en la dirección de translocación hacia adelante. (g) Curso temporal del desplazamiento x del QD unido al microtúbulo que se muestra en (d). La velocidad longitudinal se determinó ajustando la posición x – t del QD con una función lineal (línea negra), arrojando un valor de 0,055 µm s-1. (h) Curso temporal de las revoluciones del QD unido al microtúbulo que se muestra en (d). La velocidad de rotación se determinó ajustando la posición rev-t del QD con una función lineal (línea negra), arrojando un valor de 0,18 rev s-1.

Los determinantes de la direccionalidad motora de la cinesina en los microtúbulos son de considerable interés para comprender el mecanismo molecular de la motilidad de la cinesina. Aunque estudios previos han identificado las regiones de hélice del cuello y de imitación del cuello externas al núcleo catalítico que son necesarias para la motilidad del extremo negativo de las cinesinas-14, la contribución de la disposición de anclaje N-terminal de estos motores fue menos clara. Endow y Waligora descubrieron que una construcción dimérica NcdKHC1 en la que el dominio motor de la cinesina-1 se sustituye en lugar del dominio motor de Ncd, pero conserva la hélice del cuello N-terminal y el tallo de Ncd junto con el imitador del cuello de Ncd, tiene menos -motilidad dirigida al extremo, que invierte la motilidad normal del extremo positivo del motor kinesina-137. Una quimera monomérica ligada a N correspondiente, BP-nKn664, también tiene direccionalidad de extremo negativo38. Aunque estos informes sugirieron que el anclaje N-terminal puede ser importante, observaciones recientes han dejado claro que la geometría de anclaje de los motores no es un requisito absoluto para la motilidad dirigida por el extremo negativo, ya que se ha demostrado que algunas cinesinas-5 de motor N-terminal tienen motilidad dependiente del contexto menos dirigida hacia el final3,4. Sin embargo, puede haber factores específicos relacionados con la estructura de la kinesina-5 involucrados en la determinación de su dirección, ya que los mismos factores que causan el cambio de dirección en la kinesina-5 multicabezal Cin83,4, no cambian de dirección en las construcciones monoméricas de knesina-5 de Cut75 o Cin842. Por lo tanto, probamos sistemáticamente si la geometría de anclaje del terminal N es un requisito absoluto para la motilidad dirigida hacia el extremo negativo de los motores de kinesina-14. Para excluir interacciones de la cabeza, efectos de orientación de la cabeza independientes o cualquier efecto de la región del tallo en la dirección como se observa en KlpA50, utilizamos construcciones de una sola cabeza (Fig. 1). Al utilizar construcciones monoméricas nativas que difieren solo en la geometría de anclaje al sustrato, hemos demostrado que la dirección longitudinal de la motilidad de la kinesina-14 monomérica está determinada por la ubicación del terminal N o C del anclaje de kinesina. Sólo cuando el núcleo catalítico de cinesina-14 está anclado en su extremo N a través de la hélice del cuello N-terminal, se mueve hacia los extremos negativos de los microtúbulos (Figs. 2 y 3). Descubrimos que los tres núcleos catalíticos de kinesina-14 probados, incluido KlpA, tenían el mismo requisito de enlace N-terminal para generar motilidad del extremo negativo. En relación con el efecto de la geometría de anclaje, se ha descubierto que la cinesina-14 KlpA dimérica nativa de longitud completa tiene la capacidad de cambiar de dirección9. Cuando el sitio de unión de los microtúbulos en la cola N-terminal de KlpA se une al mismo microtúbulo que el dominio catalítico, cambia de la motilidad del extremo negativo a la del extremo positivo. Sugerentemente, nuestros resultados muestran que un cambio en la geometría de anclaje también puede causar una inversión de dirección en una construcción de una sola cabeza KlpA que contiene la hélice del cuello, el núcleo catalítico y el imitador del cuello de KlpA, aunque queda por determinar si los mecanismos de inversión de nuestra construcción y los KlpA nativos de longitud completa están relacionados.

Se ha propuesto que el imitador del cuello de la kinesina-14 cumple el papel de conector del cuello en otras kinesinas en la motilidad y en la regulación de la actividad de la ATPasa33, a pesar de que comparten poca homología en sus secuencias de aminoácidos. Anteriormente hemos demostrado que la motilidad dirigida al extremo positivo soportada por el imitador del cuello en una construcción anclada N-terminal (BP-nKn669) o la motilidad dirigida al extremo negativo en una construcción con 5 aminoácidos del núcleo catalítico Ncd (BP- nKn664)38. Sin embargo, no estaba claro si el imitador del cuello podría soportar la motilidad del extremo positivo en una construcción anclada en el terminal C, por lo que examinamos su función en construcciones de kinesina-14 nativa anclada en el terminal C y de kinesina-1 quimérica. Descubrimos que tanto en las construcciones nativas monoméricas de kinesina-14 como en una construcción monomérica quimérica con un núcleo catalítico de kinesina-1, el imitador del cuello de kinesina-14 podría reemplazar el conector del cuello y soportar la motilidad dirigida al extremo positivo en estos C -Construcciones ancladas terminales (Fig. 2). En la configuración de anclaje C-terminal, tanto el conector del cuello como el imitador del cuello podrían actuar para amplificar los cambios conformacionales en la cinesina y aumentar la motilidad de los microtúbulos (Tabla 1 y Figura complementaria 4). Estos resultados respaldan la opinión de que el imitador de cuello es funcionalmente equivalente al enlazador de cuello. Sin embargo, como se muestra en este estudio (Fig. 3 complementaria) y en trabajos previos37,38 para que el imitador del cuello y la hélice del cuello generen motilidad dirigida al extremo negativo en construcciones híbridas que contienen el núcleo motor de kinesina-1, un grupo de 5 También deben estar presentes aminoácidos (AASVN) del extremo C-terminal del núcleo catalítico de cinesina-14 y anclaje N-terminal. La motilidad dirigida por el extremo negativo en la quimera (NcdKHC6), que tiene un grupo de 5 aminoácidos (GRRAK) del extremo C-terminal del núcleo catalítico de kinesina-1 junto con el conector del cuello, también requiere anclaje N-terminal. . Toda la motilidad dirigida por el extremo negativo tanto para las quimeras que enlazan el cuello como para las que imitan el cuello requerían que estuvieran presentes tanto el anclaje de la hélice del cuello como el del terminal N. En este trabajo mostramos que el anclaje N-terminal a través de un enlace normal cuello-hélice al núcleo catalítico es un requisito absoluto para la motilidad dirigida al extremo negativo de construcciones de cinesina de una sola cabeza.

A diferencia de la motilidad dirigida al extremo negativo de las construcciones de kinesina de una sola cabeza, la motilidad dirigida al extremo positivo no tiene requisitos específicos para el anclaje del terminal N o C, de modo que BP-NcdRan14 con el enlace cuello-hélice al dominio catalítico interrumpido por la inserción de aminoácidos aleatorios tiene motilidad dirigida al extremo positivo incluso cuando está anclado por su extremo N (Fig. 2h y Fig. Suplementaria 3). Por lo tanto, con la pérdida de función de cualquiera de los factores de motilidad dirigidos por el extremo negativo, como el funcionamiento adecuado de la hélice del cuello, el motor de cinesina-14 pasa a estar dirigido por el extremo positivo. Esto es consistente con una sugerencia previa de que el núcleo catalítico conservado de todas las cinesinas puede tener un sesgo inherente hacia el extremo positivo39,51, siendo la motilidad del extremo negativo una ganancia de función que anula este sesgo inherente. Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que, dado que se requiere el funcionamiento adecuado de la hélice del cuello y el imitador del cuello de la kinesina-14 para la polaridad dirigida negativamente, como lo demuestran varias construcciones mutantes y quiméricas como BP-NcdRun14 (Fig. 2 y Tablas 1 y 2) y BP-nKn66938 (Figura complementaria 3), el anclaje en el extremo C de la kinesina-14 podría alterar la interacción correcta de la hélice del cuello y el imitador del cuello y luego inducir la polaridad dirigida al extremo positivo a través de una inclinación del cuello que imita hacia el extremo positivo de los microtúbulos debido al impedimento estérico. Sin embargo, un apoyo adicional para al menos tener cambios conformacionales conservados dentro del núcleo catalítico proviene del componente de par conservado de la motilidad de la cinesina. Estudios anteriores han demostrado que a pesar de tener diferentes direcciones de motilidad longitudinal a lo largo del microtúbulo, todas las cinesinas probadas tienen el mismo sesgo direccional del torque en relación con la cabeza de la cinesina12,13,14,15,16,17,18, aunque debido a la forma en que Cuando se define la rotación, esto se expresa de manera algo confusa como un "cambio" en la dirección de rotación para las cinesinas dirigidas hacia los extremos positivo y negativo. Nuestro estudio ha demostrado que cuando las construcciones de núcleo catalítico de kinesina-14, normalmente dirigidas en el extremo negativo, tienen su direccionalidad invertida para volverse dirigidas en el extremo positivo mediante el anclaje del terminal C, no solo permanece este sesgo direccional de torsión, sino que también se modifica el paso de rotación de los microtúbulos. que causa en los ensayos de motilidad (Fig. 4 y Figs. Suplementarias 6 y 7) es similar al de la kinesina-115 monomérica normalmente dirigida hacia el extremo positivo, lo que sugiere un vínculo estrecho y conservado entre los componentes longitudinales y transversales. Nuestros resultados muestran que el vínculo entre el torque y la motilidad longitudinal se mantiene en el núcleo catalítico de las familias de cinesinas kinesina-14 y kinesina-1, lo que sugiere una fuerte conservación de la función del núcleo catalítico.

Trabajos anteriores han demostrado que se requiere anclaje N-terminal para la motilidad dirigida al extremo negativo en quimeras de Ncd y kinesina-1 (Figura complementaria 3) 37,38. Nuestras observaciones muestran que en las construcciones de kinesinas-14 monoméricas nativas (Ncd, Kar3 y KlpA), la hélice del cuello, el núcleo catalítico de kinesina-14 y el imitador del cuello son insuficientes para soportar la motilidad del extremo negativo a menos que la construcción también esté anclada al sustrato a través de la hélice del cuello ubicada en el extremo N. Si las construcciones se anclan a través del imitador de cuello C-terminal, se dirigen hacia el extremo positivo. Además, la velocidad dirigida al extremo positivo de las construcciones de kinesina-14 ligadas a C siempre fue mayor que la velocidad dirigida al extremo negativo de las construcciones ligadas a N, lo que sugiere que el mismo sesgo cinético está presente en el dominio catalítico de ambas kinesina-1. y cinesina-14. Estas observaciones sugieren que la actividad predeterminada del dominio motor central catalítico de kinesina altamente conservado en las familias de kinesina-1 y kinesn-14 imparte una rotación de sacacorchos hacia la izquierda y dirigida hacia el extremo positivo a los microtúbulos. Además, el tono similar del movimiento en espiral creado por diversos motores anclados en su extremo C sugiere que el mecanismo está altamente conservado en la mayoría de las cinesinas.

Las construcciones monoméricas Ncd325 usaron 325–700 aa de Drosophila melanogaster Ncd18, Kar363 usó 363–729 aa de Saccharomyces cerevisiae Kar345 y KlpA398 usó 398–770 aa de Aspergillus nidulans KlpA9; con una secuencia de nucleótidos de etiqueta avi N-terminal o C-terminal que codifica GLNDIFEAQKIEWHE, que está biotinilada en Escherichia coli46, se clonaron en los vectores His-pColdIII (Takara, Shiga, Japón) y pET17b (Novagen). La construcción monomérica mutante de Ncd NcdRan14 con una inserción de 14 residuos aleatorios GESGAKQGEKGESG entre 346 y 347 aa, que debería interrumpir completamente la interacción cuello-hélice-núcleo motor, se clonó en el vector His-pColdIII para NcdRan14 ligado a C o en el vector pET17b para NcdRan14 ligado a N, con una etiqueta avi C o N terminal. Para la cinesina quimérica monomérica nKn664-BP, se clonó nKn664 (que comprende DmNcd K325-N348 — Rattus norvegicus KIF5C I9-K320 — DmNcd A664-K700) 38 en el vector His-pColdIII con una etiqueta avi C-terminal. Se insertaron Ncd325, Kar363 o KlpA398 en el vector Gelsolin-His-pColdIII42 para crear fusiones de gelsolina C-terminales. Todas las construcciones fueron verificadas mediante secuenciación de ADN. Consulte la Fig. 1b y la Fig. 3 complementaria para obtener más detalles.

Los plásmidos de expresión para cinesinas monoméricas fusionadas con etiqueta avi, mutante Ncd y quimera se transformaron en células BL21 Star (DE3) de la cepa Escherichia coli (Invitrogen). Después de la expresión en células BL21 Star (DE3) usando IPTG 0,1 mM (Sigma-Aldrich) durante 24 h a 15 °C para vectores His-pColdIII (Takara, Shiga, Japón) o IPTG 0,4 mM durante 6 h a 23 °C para En los vectores pET17b (Novagen), las células se sedimentaron y luego se resuspendieron en tampón de lisis (pH 7,4: PIPES-KOH 80 mM, MgCl2 1 mM, EGTA 1 mM, ATP 100 µM, DTT 1 mM, CHAPS 0,1%, Tween20 0,1%, glicerol al 10%, inhibidores de proteasa y NaCl 500 mM para proteínas marcadas con His o NaCl 40 mM para proteínas no marcadas con His) y se sonicó durante 20 minutos en hielo. Luego, el lisado se clarificó mediante centrifugación (20 min, 305.000 g, 2 °C). Las proteínas marcadas con His expresadas se purificaron mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados utilizando una columna HisTrap HP (Cytiva) y las proteínas no marcadas con His mediante cromatografía de intercambio catiónico utilizando una columna Hitrap SP HP (Cytiva). Las fracciones reunidas se intercambiaron en un tampón de desalación (NaCl 80 mM, fosfato de potasio 20 mM, MgCl2 1 mM, DTT 1 mM, ATP 20 µM, pH 7,4) usando una columna de desalación HiTrap (Cytiva) y luego se purificaron adicionalmente mediante unión por afinidad a polimerizados. microtúbulos. Los microtúbulos estabilizados con taxol se mezclaron con proteínas purificadas suplementadas con AMPPNP 1 mM y se incubaron durante 15 minutos a 25 °C. Después de eliminar las proteínas no unidas mediante centrifugación (20 min, 305.000 g, 23 °C), la cinesina unida a los microtúbulos se eluyó con un tampón que contenía ATP (ATP 10 mM, MgCl2 10 mM, acetato de potasio 200 mM, taxol 20-80 µM). en tampón M [PIPES-KOH 20 mM, MgCl2 4 mM, acetato de potasio 10 mM, EGTA 1 mM, pH 7,4]) mediante incubación durante 10 min a 25 °C. Finalmente se eliminaron los microtúbulos mediante centrifugación (20 min, 305.000 g, 23 °C)42. Las fusiones de gelsolina monomérica de kinesina-14 expresadas en bacterias se purificaron utilizando afinidad de microtúbulos estabilizada con taxol como se describe 52. Las cinesinas purificadas se congelaron instantáneamente y se almacenaron en nitrógeno líquido. Las concentraciones de kinesina-14, mutantes o quimeras se estimaron mediante SDS-PAGE en geles de acrilamida al 10% utilizando estándares BSA (Thermo Fisher Scientific) cargados en el mismo gel53. Los geles se tiñeron con Quick-CBB PLUS (Wako, Osaka, Japón) y se tomaron imágenes con una cámara CCD (CSFX36BC3, Toshiba-teli, Tokio, Japón). Las bandas que contienen quinesinas y estándares BSA se cuantificaron utilizando ImageJ (NIH).

La tubulina se purificó a partir de cerebro porcino mediante cuatro ciclos de polimerización y despolimerización con temperatura regulada en un tampón PIPES de alta molaridad para eliminar las proteínas contaminantes asociadas a los microtúbulos54. La tubulina purificada se congeló instantáneamente y se almacenó en nitrógeno líquido. Los cerebros porcinos se obtuvieron de animales muertos y fueron proporcionados por Shibaura Organ (Tokio, Japón), un proveedor autorizado de órganos animales.

Los microtúbulos marcados con polaridad marcados con Cy5 se prepararon como se describe38. Primero, se polimerizaron microtúbulos cortos brillantes (tubulina marcada: tubulina no marcada = 1: 2) con GMPCPP 0,5 mM (un análogo de GTP no hidrolizable, Jena Bioscience), luego se elongó el extremo positivo de segmentos largos oscuros (tubulina marcada: tubulina no marcada = 1: 9) se logró mediante la inclusión de tubulina tratada con NEM que inhibe la polimerización del extremo negativo. Los ensayos de deslizamiento de microtúbulos se realizaron en cámaras de flujo ensambladas a partir de cubreobjetos limpiados con KOH unidos con cinta de doble cara (NW-25, Nichiban, Tokio, Japón o Scotch W-12, 3M) como se describe38. Para los ensayos que utilizan cinesinas monoméricas fusionadas con etiqueta avi, se introdujo en la cámara de flujo 1 volumen de cámara de flujo de 5 mg ml-1 de BSA biotinilada (Sigma-Aldrich), se incubó durante 5 minutos y luego se enjuagó con 4 volúmenes de tampón M. La superficie de la cámara se recubrió secuencialmente con 1 volumen de 5 mg mL-1 de estreptavidina (Wako, Osaka, Japón) durante 10 minutos, 4 volúmenes de 5 mg mL-1 de BSA (Sigma-Aldrich) durante 3 minutos y 1 volumen de 0,5 –Ncd325, Kar363, KlpA398, NcdRan14 fusionados con etiqueta avi C-terminal N o C de 1 µM y 1 volumen de 1 µM de nKn664 fusionado con etiqueta avi C-terminal durante 3 min y luego 4 volúmenes de ~ 10 µg mL- 1 microtúbulos marcados con polaridad marcados con Cy5 en tampón BRB80 [PIPES-KOH 80 mM, MgCl2 1 mM, EGTA 1 mM, pH 6,8] que contiene 0,5 mg mL-1 de BSA y taxol 20 µM. Finalmente, se aplicaron a la cámara 4 volúmenes de tampón de motilidad (tampón M que contiene ATP 3 mM (Sigma-Aldrich), taxol 20 µM, sistema de regeneración de ATP, sistema eliminador de oxígeno, DTT 1 mM, 0,5 mg mL-1 de BSA). Este procedimiento unió las cinesinas-14 monoméricas, el mutante Ncd NcdRan14 o la quimera a la superficie del vidrio a través de sus extremos C o N. Para céspedes de kinesina-14 ligada a N o NcdRan14, la hélice del cuello se acopló al cubreobjetos mediante una etiqueta avi para que la hélice del cuello N-terminal ejerza o transmita la fuerza de deslizamiento. Por el contrario, para los céspedes de kinesina-14 ligada a C, NcdRan14 o quimera, la unión se logró a través del imitador del cuello C-terminal y se desconectó la hélice del cuello N-terminal. Todas las cámaras fueron selladas con esmalte de uñas. Los ensayos se llevaron a cabo a 24 ± 1 °C. El deslizamiento de los microtúbulos se observó utilizando un microscopio de fluorescencia (Eclipse Ti, Nikon) con una platina estable (KS-N, Chukousya Seisakujo, Tokio, Japón) y un controlador de platina (QT-CM2-35, Chuo Precision Ind., Tokio, Japón). , utilizando iluminación de un trozo de mercurio (Intensilight, Nikon), 100 × /1,49 NA, lentes de objetivo Plan-Apocromático (Nikon) y un juego de filtros Cy5 (Semrock). Las imágenes fueron grabadas con una cámara EMCCD (iXon X3 DU-897E-COO-#BV, Andor Technology). Se utilizó equipo de control de temperatura (F-12, Julabo, Alemania) para suprimir la deriva posicional, que es causada principalmente por variaciones de temperatura. La velocidad de deslizamiento de los microtúbulos se calculó dividiendo la distancia recorrida por el intervalo de tiempo (1 a 40 s) utilizando el software de seguimiento automatizado Mark2 (amablemente proporcionado por el Dr. Ken'ya Furuta, NICT)55. Sólo se analizaron los microtúbulos deslizantes que tenían > 1 µm de longitud y no se cruzaban entre sí. Se siguió un punto brillante fijo en el cubreobjetos para distinguir el desplazamiento de los microtúbulos por deriva del deslizamiento de los microtúbulos impulsado por una actividad motora lenta. La direccionalidad y las velocidades se determinaron utilizando mediciones de al menos tres ensayos independientes para cada construcción.

Los ensayos de puntos cuánticos (QD) se realizaron en cámaras de flujo ensambladas a partir de cubreobjetos silanizados hidrófobos unidos con cinta de doble cara (NW-25, Nichiban, Tokio, Japón). Se mezclaron cinesinas fusionadas con etiqueta Avi y QD recubiertos con estreptavidina (Qdot 525 conjugado con estreptavidina, Thermo Fisher Scientific) en una proporción molar de 20: 1 en tampón M durante 30 minutos en hielo. Para los ensayos que utilizan microtúbulos inmovilizados marcados con polaridad y sin polaridad, se introdujo 1 volumen de cámara de flujo de 40 μg mL-1 de anticuerpo anti-β-tubulina (Santacruz, SAP. 4G5) en la cámara de flujo, se incubó durante 10 minutos y luego se enjuagó. con 4 volúmenes de buffer M. La superficie de la cámara se recubrió secuencialmente con 1 volumen de 1% (p/v) Pluronic F-127 (Sigma-Aldrich) durante 10 min, 4 volúmenes de 5 mg mL-1 de caseína durante 3 min y 1 volumen de ~ 20 μg mL. -1 microtúbulos marcados con polaridad marcados con Cy5, que también incluían algunos microtúbulos sin polaridad, en tampón BRB80 con 0,5 mg mL-1 de caseína y taxol 20 µM. Luego, los microtúbulos no inmovilizados se lavaron con 4 volúmenes de tampón M que contenía taxol 20 µM y 0,5 mg ml-1 de caseína. Finalmente, 50–200 pM QD recubiertos con múltiples cinesinas en tampón de motilidad (tampón M que contiene ATP 3 mM (Sigma-Aldrich), taxol 20 µM, sistema de regeneración de ATP, sistema eliminador de oxígeno, DTT 1 mM y caseína 0,5 mg mL-1. ) fueron aplicados a la cámara. La concentración de cinesina requerida para unirse al QD se determinó en una evaluación preliminar para determinar las condiciones que nos permitieron observar el movimiento estable de un QD a lo largo del microtúbulo. Para lograr esto, el QD necesitaba estar recubierto con múltiples motores que pudieran actuar como un equipo. Dado que el diámetro del QD es de ~ 25 nm, puede acomodar múltiples cinesinas de 5 a 10 nm de tamaño unidas a él. Las cámaras estaban selladas con esmalte de uñas. Los ensayos se llevaron a cabo a 24 ± 1 °C. Los QD se observaron utilizando un microscopio de fluorescencia (Eclipse Ti-PFS, Nikon) con una platina estable (KS-N, Chukousya Seisakujo, Tokio, Japón) y un controlador de platina (QT-CM2-35, Chuo Precision Ind., Tokio, Japón). , utilizando iluminación de una lámpara de mercurio (Intensilight C-HGFIE, Nikon), lentes objetivo Plan-Apocromático de 100 × / 1,49 NA (Nikon) y un juego de filtros Cy5 para microtúbulos marcados con Cy5 o un juego Chroma Qdot 525 para QD. Las imágenes fueron grabadas con una cámara EMCCD (iXon X3 DU-897E-COO-#BV, Andor Technology). Se utilizó equipo de control de temperatura (F-12, Julabo, Alemania) para suprimir la deriva posicional, que es causada principalmente por variaciones de temperatura38. Analizamos los QD que mostraron un movimiento procesivo estable (> 0,25 μm) a lo largo de un microtúbulo. Se ignoraron aquellos con microtúbulos fluctuantes, agrupados o cruzados. También se excluyeron los QD que encontraron otros QD. La velocidad de transporte individual de cada QD cubierto con múltiples cinesinas monoméricas se calculó dividiendo la distancia recorrida por el intervalo de tiempo (0,3 a 2 s) utilizando el software de seguimiento automatizado Mark255. Cuando el QD dejó de moverse, el análisis se detuvo en ese punto. Las imágenes de fluorescencia de los QD se equiparon con un gaussiano 2D para localizar la posición del pico de intensidad de fluorescencia, correspondiente al centro del QD. La direccionalidad y las velocidades se determinaron utilizando mediciones de al menos tres ensayos independientes para cada construcción.

Los ensayos de sacacorchos de microtúbulos se realizaron utilizando microtúbulos recubiertos con QD como se describió anteriormente25. Se prepararon microtúbulos biotinilados (biotina-(AC5)2 Sulfo-OSu, Dojindo, Kumamoto, Japón), marcados con Cy5 (Cy5 Mono NHS Ester, Cytiva) copolimerizando tubulina biotinilada, marcada con Cy5 y no fluorescente en un molar. proporción de 1:3:75 en BRB80 con GTP 1 mM y MgCl2 1 mM durante 30 min a 37 °C y luego estabilizado con taxol 20 μM. Los microtúbulos recubiertos con QD se prepararon añadiendo QD recubierto con estreptavidina 13 nM (conjugado de estreptavidina Qdot 525, Thermo Fisher Scientific) diluido en BRB80 que contenía taxol 20 µM (BRB80T) y se incubaron durante 30 minutos con un volumen igual de microtúbulos de 4 mg ml-1. y luego se diluyó a 33 pM QD y 10 μg mL-1 de microtúbulos en BRB80T que contenía 0,4 mg mL-1 de α-caseína (Sigma-Aldrich). Los ensayos de sacacorchos de microtúbulos se realizaron en cámaras de flujo ensambladas a partir de cubreobjetos limpiados con KOH unidos con cinta de doble cara (NW-25, Nichiban, Tokio, Japón) como se describe. Para los ensayos que utilizan kinesinas monoméricas fusionadas con etiqueta His y gelsolina, se introdujo 1 volumen de cámara de flujo de 5 mg mL-1 de proteína G (Sigma-Aldrich) en la cámara de flujo, se incubó durante 5 minutos y luego se enjuagó con 4 volúmenes de tampón M. . La superficie de la cámara se recubrió secuencialmente con 1 volumen de 50 μg mL-1 de anticuerpo anti-His-tag (Qiagen) durante 10 minutos, 4 volúmenes de 0,4 mg mL-1 de α-caseína durante 3 minutos y 1 volumen de C 1 μM. Ncd325-Gel, Kar363-Gel o KlpA398-Gel fusionado con etiqueta His terminal durante 5 minutos y luego 4 volúmenes de ~ 10 µg mL-1 de microtúbulos recubiertos con QD marcados con Cy5 en BRB80 que contienen 0,4 mg mL-1 de α-caseína y taxol 20 µM. Finalmente, se aplicaron a la Cámara. Todas las cámaras fueron selladas con esmalte de uñas. Los ensayos se llevaron a cabo a 25 °C. Se utilizó equipo de control de temperatura (F-12, Julabo, Alemania) para suprimir la deriva posicional, que es causada principalmente por variaciones de temperatura. El principio del seguimiento 3D se ha descrito anteriormente15. La fluorescencia se pasó a través de un conjunto de filtros apropiado (conjunto de filtros Cy5, Semrock, para microtúbulos marcados con Cy5 y conjunto Qdot 525, Chroma, para puntos cuánticos de 525 nm). Se colocó una lente acromática-1 fuera del puerto de la cámara del microscopio para crear un plano focal posterior equivalente donde se colocó con precisión un prisma de cuña hecho a medida (86,5°) recubierto con una capa antirreflectante. Se enfocaron dos imágenes divididas de la muestra en la cámara con otra lente acromática-2 que tenía una f deseable, que determinó el aumento del sistema óptico. Para la calibración de la posición del eje z en la que el objetivo se desplazó a una velocidad constante, la platina estable se equipó con un motor de impulsos (SGSP-13ACT, SIGMAKOKI, Tokio, Japón) y un controlador (SHOT-204MS, SIGMAKOKI, Tokio , Japón). Los QD se observaron utilizando un microscopio de fluorescencia (Eclipse Ti-PFS, Nikon) con una platina estable (KS-N, Chukousya Seisakujo, Tokio, Japón) y un controlador de platina (QT-CM2-35, Chuo Precision Ind., Tokio, Japón). , utilizando iluminación de una lámpara de mercurio (Intensilight C-HGFIE, Nikon), lentes objetivo Plan-Apocromático de 100 × / 1,49 NA (Nikon) y un juego de filtros Cy5 para microtúbulos marcados con Cy5 o un juego Chroma Qdot 525 para QD. Las imágenes se grabaron a intervalos de 0,5 a 1 s con una cámara EMCCD (iXon X3 DU-897E-COO-#BV, Andor Technology). El movimiento QD fue rastreado y cuantificado con Igor Pro 5.05A15. La destreza y el tono se determinaron utilizando mediciones de al menos tres ensayos independientes para cada construcción.

Los datos de seguimiento de microtúbulos y QD se obtuvieron de al menos 3 experimentos independientes, y los tamaños de las muestras se indican en detalle en el texto o en la sección Método.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Todos los plásmidos utilizados en este estudio están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Los datos fuente de este estudio utilizados para preparar los gráficos y tablas se proporcionan como Datos complementarios 1.

Se escribieron scripts personalizados para rastrear QD unidos a microtúbulos deslizantes con Igor Pro 5.05A. Los guiones están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Agradecemos a M. Sugawa por la asistencia técnica y a K. Furuta por el software de seguimiento Mark2. Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI (número de subvención JP16KT0065, JP20K06635, JP21K19252 para JY y JP20K15744 para MY), por la subvención MEXT KAKENHI para investigación científica en áreas innovadoras (número de subvención JP21H00386, JP21H05868 para JY).

Departamento de Ciencias de la Vida, Escuela de Graduados en Artes y Ciencias, Universidad de Tokio, 3-8-1 Komaba, Meguro-ku, Tokio, 153-8902, Japón

Masahiko Yamagishi, Rieko Sumiyoshi y Junichiro Yajima

Centro para la Promoción de la Educación y la Investigación Internacional, Facultad de Agricultura, Universidad de Kyushu, 744 Motooka, Nishi-ku, Fukuoka, 819-0395, Japón

Douglas R. Drummond

Escuela de Ciencia Interdisciplinaria e Innovación, Universidad de Kyushu, 744 Motooka, Nishi-ku, Fukuoka, 819-0395, Japón

Douglas R. Drummond

Instituto Komaba de Ciencias, Universidad de Tokio, 3-8-1 Komaba, Meguro-ku, Tokio, 153-8902, Japón

Junichiro Yajima

Centro de Investigación de Biología de Sistemas Complejos, Universidad de Tokio, 3-8-1 Komaba, Meguro-ku, Tokio, 153-8902, Japón

Junichiro Yajima

Instituto Biológico Universal, Universidad de Tokio, Bunkyo-ku, Tokio, 113-0033, Japón

Junichiro Yajima

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JY diseñó el proyecto. MY construyó las proteínas y realizó un ensayo de motilidad. MY y RS purificaron las proteínas. JY, MY y DD interpretaron los datos y escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Junichiro Yajima.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Yamagishi, M., Sumiyoshi, R., Drummond, DR et al. La geometría de anclaje es un factor importante para determinar la dirección de la motilidad de la kinesina-14 en los microtúbulos. Informe científico 12, 15417 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-19589-4

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Recibido: 03 de junio de 2022

Aceptado: 31 de agosto de 2022

Publicado: 14 de septiembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-19589-4

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