Estructuras del TMC

Nature volumen 610, páginas 796–803 (2022)Cite este artículo

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El paso inicial en la vía de transducción sensorial que sustenta la audición y el equilibrio en los mamíferos implica la conversión de fuerza en la activación de un canal de transducción mecanosensorial1. A pesar de los profundos impactos socioeconómicos de los trastornos auditivos y la importancia biológica fundamental de comprender la transducción mecanosensorial, la composición, estructura y mecanismo del complejo de transducción mecanosensorial siguen estando mal caracterizados. Aquí presentamos la estructura de microscopía crioelectrónica de una sola partícula del complejo de transducción mecanosensorial de la proteína 1 similar al canal transmembrana nativo (TMC-1) aislado de Caenorhabditis elegans. El complejo doblemente simétrico se compone de dos copias de cada una de la subunidad TMC-1 formadora de poros, la proteína de unión a calcio CALM-1 y la proteína transmembrana del oído interno TMIE. CALM-1 establece amplios contactos con la cara citoplasmática de las subunidades TMC-1, mientras que las subunidades TMIE de paso único residen en la periferia del complejo, suspendidas como las manijas de un acordeón. Un subconjunto de complejos incluye además una única proteína similar a la arrestina, la proteína del dominio de arrestina (ARRD-6), unida a una subunidad CALM-1. Las reconstrucciones de partículas individuales y las simulaciones de dinámica molecular muestran cómo el complejo de transducción mecanosensorial deforma la bicapa de la membrana y sugieren funciones cruciales para las interacciones lípido-proteína en el mecanismo por el cual la fuerza mecánica se transduce a la activación de canales iónicos.

El sistema auditivo tiene una capacidad notable para detectar una amplia gama de frecuencias y amplitudes de ondas acústicas mediante la transducción de energía mecánica vibratoria en despolarización del potencial de membrana, seguida del procesamiento de señales en los centros cerebrales superiores, permitiendo así la sensación de sonido1. La disfunción del sistema auditivo por lesión, agresión ambiental o mutación genética se asocia con la pérdida de audición relacionada con la edad. La discapacidad auditiva y la sordera afectan a más de 460 millones de personas en todo el mundo, con un costo anual estimado de pérdida auditiva no abordada de entre 750 y 790 mil millones de dólares. La entrada al sistema auditivo y al sistema vestibular estrechamente relacionado, como ocurre con otros sistemas sensoriales, se inicia mediante la activación de receptores en las neuronas periféricas. A pesar de una intensa investigación durante varias décadas, la composición molecular, la estructura y el mecanismo del complejo de transducción mecanosensorial (MT), el receptor de la transducción mecanosensorial, siguen sin resolverse.

Múltiples líneas de investigación, a partir de estudios en humanos y organismos modelo, incluidos ratones, pez cebra y C. elegans, han arrojado luz sobre las proteínas que forman el complejo MT y sus probables papeles en su función2. Estas incluyen las proteínas de enlace de punta, protocadherina-15 y cadherina-23, que en las células ciliadas transducen la fuerza derivada del desplazamiento de los estereocilios hacia la apertura del componente del canal iónico del complejo MT3,4. TMC-1 y TMC-2 son las probables subunidades formadoras de poros del complejo MT, candidatos que adquirieron importancia por primera vez en estudios genéticos humanos5 y ganaron fuerza más recientemente como vía de conducción de iones a través de investigaciones biofísicas y bioquímicas6,7,8. . Proteínas adicionales, algunas de las cuales pueden ser subunidades auxiliares, se han asociado con la biogénesis o la función del complejo MT e incluyen TMIE9,10,11, Ca2+ y la proteína de unión a integrina 212,13,14 (CIB2), fusión de lipoma HMGIC- como la proteína 515,16,17 (LHFPL5), la O-metiltransferasa transmembrana18,19 (TOMT) y posiblemente la anquirina13.

Hasta el momento, el aislamiento del complejo MT a partir de fuentes de vertebrados o la producción de un complejo funcional mediante métodos recombinantes no han tenido éxito. La purificación de complejos a partir de fuentes nativas es particularmente desafiante debido a la pequeña cantidad de complejos por animal, estimada en aproximadamente 3 × 106 por cóclea de mamífero20, una cantidad pequeña en comparación con la cantidad de fotorreceptores en el sistema visual, que es aproximadamente 4 × 1014 por ojo. en ratón21. Para superar los desafíos con la disponibilidad del complejo MT de vertebrados, recurrimos a C. elegans, un animal que utiliza un complejo MT para detectar estímulos táctiles. Primero observamos que C. elegans expresa componentes cruciales del complejo MT de vertebrados, incluidas las proteínas TMC-1 y TMC-2, además de un homólogo de CIB2 conocido como CALM-1, así como TMIE13. En segundo lugar, los gusanos que no tienen TMC-1 exhiben respuestas atenuadas al tacto ligero13. En tercer lugar, a pesar de la expresión limitada de las proteínas TMC en C. elegans, es factible cultivar una cantidad suficiente de gusanos para aislar suficientes complejos para estudios estructurales. Por lo tanto, modificamos el locus tmc-1 de C. elegans al incluir un indicador fluorescente y una etiqueta de afinidad, lo que nos permite monitorear la expresión mediante fluorescencia de animales completos y cromatografía de exclusión por tamaño con detección de fluorescencia (FSEC)22, y aislar el TMC. -1 complejo por cromatografía de afinidad. Junto con estudios computacionales, dilucidamos la composición, la arquitectura y las interacciones de membrana del complejo, y sugerimos mecanismos para la apertura del poro del canal iónico mediante interacciones proteicas directas y a través de la bicapa de membrana.

Generamos una línea de gusano transgénico knock-in en la que se insertó una secuencia de ácido nucleico que codifica mVenus con una etiqueta 3×Flag en el extremo 3' de la secuencia codificante de TMC-1, inmediatamente antes del codón de parada (Figura complementaria 1). Caracterizamos la línea de gusano homocigoto diseñada (tmc-1::mVenus) mediante imágenes confocales espectrales, que revelan fluorescencia de mVenus en las neuronas de la cabeza y la cola, la pared corporal y los músculos vulvares (Datos ampliados, Fig. 1a), de acuerdo con estudios previos que demuestran la expresión. de TMC-1 en estas células23. El complejo TMC-1 se aisló de los gusanos transgénicos tmc-1::mVenus mediante cromatografía de afinidad y se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (Datos ampliados, figura 1b). El peso molecular estimado del complejo TMC-1 mediante SEC es ~780 kDa, lo que sugiere que el complejo alberga múltiples protómeros de TMC-1 y quizás subunidades auxiliares adicionales.

Para interrogar de forma independiente el estado oligomérico del complejo, realizamos experimentos de extracción de una sola molécula (SiMPull)24. Los rastros de fotoblanqueo de los complejos TMC-1 capturados demuestran que alrededor del 62% de los fluoróforos de mVenus se blanquearon en dos pasos, el 37% se blanquearon en un paso y el 1% se blanquearon en tres pasos (Datos ampliados, figuras 1c-e), de acuerdo con la conclusión. que hay dos copias de la subunidad TMC-1 dentro del complejo TMC-1. La discrepancia entre la masa molecular prevista de un dímero TMC-1 de C. elegans de aproximadamente 300 kDa y la del complejo estimado por SEC apunta hacia la presencia de proteínas auxiliares. Como se han identificado varios socios de unión de TMC-1 en gusanos13 y en vertebrados2, a continuación investigamos la composición del complejo TMC-1 mediante espectrometría de masas.

El análisis de espectrometría de masas del complejo TMC-1 identificó tres proteínas que se copurificaron con TMC-1: (1) CALM-1, un ortólogo de CIB2 de mamíferos; (2) un ortólogo de TMIE; (3) ARRD-6, un ortólogo de la familia de proteínas que contienen el dominio de arrestina de mamíferos (Datos ampliados, figura 2). Las tres proteínas se encontraron en la muestra de TMC-1 purificada a partir de gusanos transgénicos, pero no en la muestra de control preparada a partir de gusanos de tipo salvaje, lo que coincide con su asociación específica con el complejo TMC-1. El ortólogo de mamíferos CIB2 y TMIE son probablemente componentes del complejo MT de mamíferos; se localizan en los estereocilios9,10,11,12,14,25 y se unen a fragmentos de TMC-1 expresados ​​exógenamente en ensayos desplegables10. Por el contrario, ARRD-6 no se ha descrito como un componente de los complejos TMC-1 de C. elegans ni de vertebrados. A pesar de los repetidos esfuerzos, no encontramos evidencia de la presencia de UNC-44, el ortólogo del gusano ankyrin de los mamíferos, en contraste con un informe anterior de que UNC-44 forma un complejo con CALM-1, es necesario para la mecanotransducción mediada por TMC-1. y es el 'resorte de entrada' del complejo TMC-113, planteando así la cuestión del papel de UNC-44 y, por extensión, anquirina, en la estructura y función de los complejos MT en gusanos y vertebrados, respectivamente.

Para dilucidar la arquitectura y disposición de las subunidades en el complejo TMC-1, realizamos microscopía crioelectrónica de partícula única (crio-EM). TMC-1 se expresa en un nivel bajo en C. elegans y necesitábamos aproximadamente 6 × 107 gusanos transgénicos para producir aproximadamente 50 ng del complejo TMC-1 para el análisis crio-EM. El complejo TMC-1 se visualizó en rejillas recubiertas de carbono de 2 nm que se descargaron luminiscentemente en presencia de amilamina. Las imágenes crio-EM revelaron una distribución de partículas casi ideal y procedimos a recopilar un conjunto de datos que comprende 26.055 películas. La reconstrucción de clasificación 3D sin referencias junto con las mejoras dieron como resultado tres clases bien definidas (Datos extendidos, figuras 3 a 5 y Tabla de datos extendidos 1). Dos de estas clases representan el complejo TMC-1 en diferentes estados conformacionales, denominadas conformaciones 'expadida' (E) y 'contraída' (C), las cuales exhiben una resolución general de 3,1 Å (Datos ampliados, figuras 3 y 5). ). Una tercera clase incluye la subunidad auxiliar ARRD-6 y se resolvió con una resolución de 3,5 Å (Datos ampliados, figuras 4 y 5). Debido a que la conformación E tiene algunas características de densidad más distintas que la conformación C, nos centraremos en la conformación E en nuestra discusión inicial de la estructura general.

El complejo TMC-1 existe como un dímero, con un eje doble de simetría rotacional centrado en un sitio de contactos entre las dos subunidades TMC-1 (Fig. 1). Las hélices transmembrana exhiben una mejor resolución local que el promedio, mientras que los componentes periféricos dinámicos o desordenados del complejo se resuelven con una resolución más baja (Fig. 1b). Cuando se ve perpendicular al plano de la membrana, el complejo tiene la forma de un ocho, con las subunidades TMC-1 centradas dentro de los lóbulos de los ocho (Fig. 1d). Cada protómero TMC-1 consta de diez hélices transmembrana con una disposición general que recuerda a la escramblasa lipídica activada por Ca2+26, los canales Cl− TMEM1627 y los canales iónicos mecanosensibles OSCA28,29 (Datos ampliados, Fig. 6), de acuerdo con las estructuras predichas de TMC-17,30. En la unión de los lóbulos en forma de ocho, la interfaz del dímero está compuesta por hélices transmembrana 10 (TM10) de dominio intercambiado (Fig. 1e), con contactos definidos por van der Waals e interacciones electrostáticas, y por entierro de 1.781 Å2 de superficie accesible al disolvente. Numerosas moléculas lipídicas bien ordenadas rodean el dominio transmembrana, muchas de las cuales están intercaladas en los surcos entre las hélices transmembrana y algunas de las cuales están ubicadas en grandes ángulos con respecto al plano de la membrana.

a, Representación esquemática de construcciones proteicas que se copurificaron con TMC-1. EF1–EF3, dominios de mano EF; TM, dominio transmembrana. b, Mapa de resolución local del complejo nativo TMC-1 después de la reconstrucción 3D. c, Arquitectura general del complejo TMC-1 nativo, visto en paralelo a la membrana. TMC-1 (azul oscuro y azul claro), CALM-1 (naranja y amarillo) y TMIE (rojo y rosa) se muestran en un diagrama de dibujos animados. Las moléculas similares a los lípidos, los N-glicanos y los iones putativos son de color negro, verde y rojo oscuro, respectivamente. d, Vista citosólica del mapa reconstruido ajustado al modelo. Las densidades de las subunidades están coloreadas como en c y la micela de detergente se muestra en gris. e, Una vista extracelular de arriba hacia abajo del complejo TMC-1 muestra la interfaz dimérica de dominio intercambiado. Las hélices α se representan como cilindros.

Preparado para realizar extensas interacciones con la valva interna de la membrana, el dominio citosólico incluye seis hélices orientadas casi paralelas a la membrana. Las dos hélices ubicadas más cerca de la valva interna, la hélice 3 (H3) y H4, son anfipáticas, una característica común entre los canales iónicos mecanosensibles31 (Fig. 1c, d). El conector corto entre TMC-1 H3 y H4 está compuesto por residuos no polares que interactúan con la membrana interna de la valva, formando contactos hidrofóbicos con las cadenas de acilo de dos lípidos. El extremo C citosólico de aproximadamente 400 residuos de TMC-1, que se predice que estará parcialmente estructurado, no era visible en el mapa crio-EM. Debido a que el análisis de espectrometría de masas del complejo MT purificado identificó nueve péptidos que abarcaban la totalidad del extremo C, sospechamos que esta región está intacta en el complejo TMC-1, pero no es visible debido a la heterogeneidad conformacional (Datos ampliados, figura 2).

Tres bucles parcialmente estructurados decoran el lado extracelular del complejo TMC-1. Dos de los bucles tienen aproximadamente 60 residuos de longitud, unen TM1-TM2 y TM9-TM10, y están bien conservados entre los vertebrados y C. elegans TMC-1. Las características de densidad compatibles con la glicosilación se pueden encontrar en N209, ubicado en el bucle entre TM1 y TM2. Por el contrario, el bucle extracelular de aproximadamente 200 residuos que conecta TM5 y TM6 no se observó en el mapa crio-EM. Detectamos dos péptidos de esta región en el análisis de espectrometría de masas (Datos ampliados, figura 2), lo que indica que el bucle está presente pero no es visible debido a la flexibilidad. Se prevé que esta región contenga elementos de estructura secundaria, así como tres sitios previstos de glicosilación ligada a N, pero su función no está clara. El bucle no está bien conservado entre TMC-1 y TMC-2, y su longitud en TMC-1 de vertebrados, alrededor de 50 residuos, es sustancialmente más corta.

Dos subunidades adicionales, CALM-1 y TMIE, presentes en dos copias cada una, completan el conjunto de proteínas asociadas con el complejo "central" TMC-1. La calidad del mapa crio-EM permitió la asignación inequívoca de las subunidades auxiliares CALM-1 y TMIE (Fig. 1c) a las características de densidad del mapa complejo TMC-1, de acuerdo con los datos de espectrometría de masas. Las subunidades CALM-1 "agarran" las caras citosólicas de cada protómero TMC-1, y cada una de las dos subunidades TMIE atraviesan la membrana, casi "flotando" en la periferia del complejo, flanqueando cada subunidad TMC-1. CALM-1 establece amplios contactos con cinco de las seis hélices citosólicas, formando una "tapa" en la base del dominio transmembrana de TMC-1. Por el contrario, las subunidades TMIE definen los bordes distales del complejo y participan sólo en un puñado de contactos proteína-proteína en los límites extracelular y citosólico de las regiones que atraviesan la membrana, pero con interacciones mediadas por lípidos a través de las regiones transmembrana. Visto paralelo a la membrana y perpendicular a la cara larga del complejo, la disposición de las subunidades se asemeja a un acordeón, con las hélices transmembrana TMIE formando los mangos del instrumento y el dominio transmembrana TMC-1 definiendo los fuelles (Fig. 1c).

TMIE es una subunidad esencial del complejo MT de vertebrados que es necesaria para la transducción mecanosensorial mediada por TMC-1 en células ciliadas cocleares32 y en células ciliadas sensoriales de pez cebra10. Múltiples mutaciones puntuales en TMIE están relacionadas con la sordera (Datos ampliados, figura 7), y estudios recientes sugieren un papel para TMIE en la localización de TMC-1 y TMC-2 y en la activación de canales9,10,11,33,34,35. El complejo C. elegans TMC-1 contiene dos copias de TMIE ubicadas en el "exterior" de cada protómero TMC-1 (Fig. 2a). TMIE consta de un único dominio transmembrana seguido de un conector en forma de codo y una hélice citosólica (Fig. 2b). La cola C-terminal flexible y cargada positivamente no era visible en el mapa crio-EM. La interacción entre TMIE y TMC-1 está mediada principalmente por el codo citosólico de TMIE, con R49 y R52 altamente conservados formando enlaces de hidrógeno con átomos de carbonilo de la columna vertebral en TMC-1 TM6 y TM8, respectivamente (Fig. 2c, e). Estos residuos de arginina se pueden asignar a mutaciones conocidas de sordera en humanos (R81C y R84W), lo que destaca la importancia de estos enlaces de hidrógeno en la interacción TMIE-TMC-1. Los contactos hidrofóbicos entre residuos no polares en el codo TMIE y TMC-1 TM6 probablemente fortalecen el complejo. Además, W25 de TMIE, cerca del límite extracelular, hace contacto con L228 en el circuito entre TMC-1 TM1 y TM2 (Fig. 2d). La mutación del residuo correspondiente en humanos (W57) a un codón de parada es una causa de sordera36. No observamos densidad para los 17 residuos N-terminales de TMIE en el mapa crio-EM, y los péptidos de esta región no se detectaron en el análisis de espectrometría de masas, lo que sugiere que el extremo N contiene un péptido señal escindido (Figura complementaria 2). ). La secuenciación N-terminal de TMIE de ratón expresado recombinantemente también es consistente con la escisión de un péptido señal (Figura 2 complementaria), al igual que los experimentos de truncamiento de TMIE10 de pez cebra, lo que respalda la hipótesis de que en C. elegans los primeros aproximadamente 17 residuos de TMIE funcionan como un péptido señal.

a, La representación esquemática de las hélices transmembrana de TMC-1 (azul) y TMIE (roja) resalta la proximidad de TMIE a la supuesta vía de conducción iónica de TMC-1. La palmitoilación de TMIE C44 y fosfolípidos (PL) se muestra en negro. b, Descripción general de la interfaz de interacción entre TMIE y TMC-1, vista desde un lado. c, La interfaz entre el 'codo' TMIE y TMC-1. Los residuos que interactúan se muestran como barras. d, La interfaz entre la hélice transmembrana de TMIE y TMC-1, destacando residuos y lípidos clave. La palmitoilación se muestra en rojo y los fosfolípidos se muestran en negro. e, Alineamiento de secuencias múltiples de ortólogos de TMIE. Los elementos de la estructura secundaria se muestran encima de las secuencias y los residuos clave se indican con flechas negras. Los residuos en negro no se conservan, los de rojo se sustituyen de forma conservadora y los de rojo negrita se conservan.

TMIE y TMC-1 forman una cavidad intramembranosa que está ocupada por múltiples moléculas de detergente o lípidos. Varios lípidos establecen contactos hidrófobos con residuos no polares en TMIE y las supuestas hélices TMC-1 formadoras de poros TM6 y TM8, uniendo las dos subunidades. De acuerdo con la densidad de lípidos observada en los mapas crio-EM, las simulaciones de dinámica molecular identifican de forma independiente múltiples lípidos en esta cavidad (Datos ampliados, figura 10). En particular, el C44 de TMIE en el límite citosólico del dominio transmembrana está palmitoilado, con la cadena de acilo extendiéndose a lo largo de TMC-1 TM8 (Fig. 2d, e). La ubicación de TMIE cerca del supuesto poro TMC-1 y sus interacciones con lípidos sugiere funciones para TMIE, y posiblemente para los lípidos, en la activación mediante la detección de la tensión de la membrana. Esta idea está respaldada por estudios recientes en células ciliadas cocleares de ratón, que demostraron que TMIE se une a los fosfolípidos y que su asociación con los lípidos es importante para la transducción mecanosensorial de TMC-111.

CIB2 y su homólogo, CIB3, modulan la actividad del complejo MT y se unen a la subunidad TMC-112,14. De acuerdo con el papel de CIB2 y CIB3 en la función del canal MT, los mutantes de CIB2 se asocian con pérdida auditiva no sindrómica25,37,38. Nuestros resultados de espectrometría de masas (Datos ampliados, Fig. 2) demuestran que CALM-1, el ortólogo de C. elegans de CIB2, se purifica conjuntamente con TMC-1, lo que es consistente con CALM-1 que reside dentro del complejo TMC-1. La inspección del mapa del complejo TMC-1 revela características de densidad para dos subunidades CALM-1 en las caras citosólicas de cada protómero TMC-1. Utilizando la estructura cristalina de CIB3 en complejo con un péptido TMC-114, ajustamos los modelos de CALM-1 a sus respectivas características de densidad (Fig. 3a). Al igual que otras proteínas CIB, CALM-1 tiene tres motivos de mano EF, dos de los cuales están ubicados proximales al extremo C y albergan iones Ca2+ claramente unidos. Después de la superposición, la desviación cuadrática media entre CALM-1 y CIB3 del complejo peptídico CIB3-TMC-1 es de 0,69 Å y, junto con una similitud de secuencia sustancial, subraya la conservación de la secuencia y la estructura entre las proteínas del gusano y del ratón. (Figura complementaria 3).

a, b, La interfaz de unión entre CALM-1 y TMC-1 vista paralela a la membrana (a) y perpendicular a la membrana (b). c, Interfaz de enlace entre CALM-1 y TMC-1 H1 – H3. Se muestra la superficie electrostática de TMC-1, donde el azul representa regiones positivas y el rojo representa regiones negativas. CALM-1 se muestra en amarillo. d, La interfaz entre CALM-1 y TMC-1 H5 y H6. e, Puentes salinos entre el extremo C de CALM-1 y TMC-1. Los supuestos enlaces de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas. f, Reconstrucción tridimensional del complejo TMC-1 con ARRD-6 visto paralelo a la membrana. TMC-1, CALM-1, TMIE y ARRD-6 se muestran en azul, amarillo, rojo y verde, respectivamente. El rectángulo discontinuo rojo indica el supuesto sitio de inserción del bucle de borde C ARRD-6 en la micela. Sobre la reconstrucción se muestra un diagrama esquemático de ARRD-6, con los dominios arrestina N- (Arr-N) y C- (Arr-C). g, La interfaz entre el bucle del borde C de ARRD-6 y la membrana. Los residuos de ARRD-6 que probablemente participan en interacciones de membrana se muestran como barras. h, La interfaz entre ARRD-6 (verde) y CALM-1 (amarillo), destacando los residuos que son importantes para la interacción de unión.

Amplias interacciones unen a CALM-1 y TMC-1, involucrando un área de superficie enterrada de alrededor de 2903 Å2 y lo que sugiere que CALM-1 puede unirse a TMC-1 con alta afinidad (Fig. 3a). Tres regiones distintas de CALM-1 interactúan con las características helicoidales citosólicas de TMC-1, la primera de las cuales involucra las hélices H1 a H3 de TMC-1, orientadas como 'paletas' casi paralelas a la membrana (Fig. 3b, c). Las interacciones prominentes incluyen cadenas laterales en el bucle entre H1 y H2, que forman contactos hidrófobos con CALM-1, junto con residuos ácidos en CALM-1 que crean una superficie cargada negativamente yuxtapuesta a una superficie complementaria cargada positivamente en la paleta H1-H3 ( Figura 3c). La segunda interfaz de unión es a través de un bolsillo hidrofóbico de CALM-1, compuesto por sus motivos de mano EF y las hélices citosólicas H5-H6 de TMC-1 (Fig. 3d), que recuerdan a la estructura peptídica CIB3-TMC-1. Los residuos alifáticos y aromáticos, incluidos L308, F309 e Y314 de TMC-1, se acoplan al núcleo hidrofóbico conservado en CALM-1, lo que estabiliza aún más el complejo mediante el enterramiento de una superficie sustancial no polar. Finalmente, los aminoácidos D192, R195 y R200 en el extremo C de CALM-1 interactúan con R780, D313 y E160 de TMC-1, respectivamente, formando puentes salinos conservados a través de la hélice corta enterrada (191-197) de CALM-1 ( Figura 3e). Esta interfaz muestra que CALM-1 se acopla directamente con las hélices transmembrana de TMC-1 a través del bucle entre TM8 y TM9 y, por lo tanto, está posicionado para modular la función del canal iónico.

Múltiples mutaciones sin sentido de CIB2 o TMC-1 humano se asocian con pérdida auditiva no sindrómica al impedir la interacción entre TMC-1 y CIB2 o al reducir la propensión a unirse a Ca2+ de CIB214. Varios de estos residuos, E178D de TMC-1 humano y E64D, F91S, Y115C, I123T y R186W de CIB2, están conservados estructuralmente en el complejo C. elegans TMC-1 y CALM-1 (Figura complementaria 3). Nuestra estructura ilumina la proximidad de los sitios de unión de CALM-1 Ca2+ a la interfaz CALM-1 y TMC-1, subrayando así las funciones de Ca2+ y CALM-1 en esculpir la conformación de TMC-1 y, por extrapolación, proporcionando una Comprensión estructural de CIB2 en la función de las células ciliadas.

El análisis de espectrometría de masas del complejo TMC-1 indicó la presencia de la proteína soluble ARRD-6. Tras la clasificación de los datos crio-EM de una sola partícula, observamos una clase 3D no doblemente simétrica definida por una característica de densidad alargada que sobresale de la subunidad auxiliar CALM-1 y planteamos la hipótesis de que correspondía a ARRD-6. Las arrestinas están compuestas por un dominio N y un dominio C, cada uno compuesto por motivos sándwich β, que juntos dan lugar a una proteína con forma alargada similar a la de un frijol. Ajustamos la estructura predicha de ARRD-6 en la característica de densidad correspondiente y, aunque la resolución local de la región ARRD-6 es menor que la de la región central del complejo, el ajuste arrojó coeficientes de correlación generales de 0,69 (máscara) y 0,65 ( volumen) (Datos ampliados Fig. 5). Además, las características de densidad de las láminas β de ARRD-6 se observan claramente en la interfaz de unión con CALM-1, así como de los bucles alargados cruzados de los dominios N y C en la cresta central, lo que respalda aún más la asignación de la densidad. función a ARRD-6. Observamos una estructura de 'bucle de borde C', ubicada en el borde distal de las hebras β en el dominio C, una característica que funciona como un anclaje de membrana y es necesaria para la activación de arrestina39 (Fig. 3f, g). El bucle del borde C de ARRD-6 incluye W197 y múltiples residuos de cisteína (Fig. 3g), el último de los cuales puede estar palmitoilado y, por lo tanto, preparado para el anclaje a la membrana40. Los contactos adicionales entre CALM-1 y ARRD-6 implican un bucle de CALM-1 (P51-K67) con las cadenas β en el dominio C de ARRD-6 (Fig. 3h). La alineación estructural muestra que la conformación TMC-1 dentro del complejo ARRD-6 es más similar a la conformación E. Aún se desconocen las funciones de la arrestina en la función del canal TMC de C. elegans y en el complejo TMC-1 de los vertebrados. Especulamos que ARRD-6 puede tener un papel regulador en la función del canal TMC-1 o estar involucrado en la endocitosis del complejo TMC-1 mediante el reclutamiento de proteínas del citoesqueleto, similar al papel de la α-arrestina en la regulación de la proteína G. receptores acoplados41. En este momento, no sabemos por qué observamos solo una subunidad ARRD-6 unida al complejo, ya que hay suficiente espacio para dos. Una subunidad puede estar separada del complejo o la segunda subunidad puede estar ocupada sólo parcialmente. Se requieren más experimentos para abordar estas preguntas.

Las corrientes de un solo canal medidas a partir de células ciliadas cocleares demuestran que el complejo MT de los mamíferos es catiónico selectivo42 con una alta permeabilidad al Ca2+. TMC-1 o TMC-2 son las subunidades probables formadoras de poros del complejo MT de mamíferos, y los experimentos de mutagénesis de cisteína han identificado varios residuos del revestimiento de poros que son críticos para la transducción mecanosensorial mediada por TMC-16,7 (Datos ampliados, Fig. 7a). C. elegans TMC-1 media la mecanosensibilidad en las neuronas OLQ de los gusanos y los músculos de la pared corporal13, pero se desconocen su selectividad iónica y sus propiedades de permeación, en gran parte debido a los desafíos asociados con la expresión heteróloga del complejo recombinante y con cantidades cada vez más pequeñas de material nativo. En particular, C. elegans y TMC-1 de ratón también funcionan como canales de fuga permeables a Na+ que modulan el potencial de membrana en reposo a través de una conductancia de fuga de fondo despolarizante, lo que sugiere que TMC-1 puede desempeñar múltiples funciones celulares23,43 e indica que el poro del canal está permeable a una mayor diversidad de iones de lo que se apreciaba anteriormente.

Para comprender mejor la naturaleza y función de la vía de conducción iónica TMC-1 de C. elegans, superpusimos la subunidad TMC-1 en las estructuras de TMEM16A y OSCA1.2, revelando una arquitectura similar entre los dominios transmembrana (Figura de datos ampliados). .6). Los conjuntos de dímeros TMEM16A y OSCA1.2 contienen dos poros (uno dentro de cada subunidad) que están definidos por las hélices TM3-TM7. Las similitudes estructurales entre TMEM16a y OSCA1.2 sugieren que TMC-1 también puede tener dos poros y podría conducir iones a través de una vía estructuralmente análoga compuesta de TM4-TM8 (Fig. 4a). La supuesta vía de conducción iónica parece estar cerrada, con un poro estrecho bloqueado por tres constricciones (Fig. 4b, c). Los residuos polares y básicos recubren el primer sitio de constricción cerca de la entrada del poro extracelular y los residuos no polares dominan el segundo sitio de constricción, ubicado aproximadamente 20 Å más abajo en la vía de conducción, hacia el citoplasma. La ubicación del segundo sitio de constricción se alinea bien con la región estrecha del "cuello" del supuesto poro OSCA1.2, que está compuesto principalmente por residuos hidrofóbicos, así como con la puerta hidrofóbica TMEM16a28,44. Los 40 Å restantes de la vía de conducción están revestidos principalmente por residuos polares y cargados (Fig. 4d). Siete residuos básicos recubren el poro, dos de los cuales (H404 y H731) definen parcialmente el tercer y más estrecho sitio de constricción. Los experimentos de mutagénesis con cisteína han identificado ocho residuos que recubren los poros en TMC-17 de ratón,45 y, aunque cinco de estos residuos no se conservan en C. elegans, las ubicaciones de los ocho se asignan a las posiciones que recubren los poros en C. elegans TMC-1. (Datos ampliados, figura 7a), lo que respalda su ubicación en la vía de conducción iónica. Visualizamos dos densidades esféricas no proteicas cerca de dos residuos ácidos (D683 y D695) que pueden corresponder a cationes unidos (Fig. 4b). Sin embargo, con la resolución actual de la estructura, no podemos determinar si estas características son iones Ca2+. Ambos residuos de asparagina se conservan en el TMC-1 humano, lo que sugiere que son importantes para la coordinación de iones. Aunque los residuos ionizables que recubren el poro cerrado son predominantemente básicos y, por lo tanto, no están en consonancia con un canal canónico permeable al Ca2+, que normalmente alberga residuos ácidos, aún se desconoce qué residuos recubren la vía de permeación en la conformación abierta. Además, la composición general del residuo es similar a la del canal iónico mecanosensible OSCA1.228. OSCA1.2 muestra corrientes catiónicas no selectivas activadas por estiramiento con una permeabilidad de Cl− del 17 al 21 %, lo que sugiere que C. elegans TMC-1 puede exhibir propiedades de permeación similares.

a, La ubicación del poro (malla dorada) se muestra en el contexto del complejo TMC-1. Los supuestos iones de calcio se muestran como esferas rojas. b, Una vista ampliada de la vía de permeación de iones, destacando los residuos que recubren los poros, mostrados como barras y los iones putativos (rojo). c, radio de van der Waals del poro representado contra la distancia a lo largo del eje del poro, calculado por MOLE 2.0. d, El potencial electrostático de los residuos del revestimiento de los poros se representa en diferentes colores: gris, no polar; amarillo, polar; rojo, ácido; y azul, básico. Los residuos ácidos y básicos están etiquetados. e, Alineamiento de secuencias múltiples de residuos seleccionados de supuestas hélices formadoras de poros de TMC-1.

Para visualizar el poro de conducción iónica del complejo MT de vertebrados, explotamos la estructura del complejo C. elegans y construimos un modelo de homología del complejo TMC-1 humano que incluye TMC-1, CIB2 y TMIE (Datos ampliados, figura 8). ). Tras la inspección de esta estructura, encontramos que el supuesto poro está revestido por dos residuos básicos y cinco residuos ácidos, de acuerdo con que el canal es permeable al Ca2+. Además, hay relativamente más residuos polares en comparación con el ortólogo del gusano y los residuos de histidina que ocluyen el segundo sitio de constricción en C. elegans TMC-1 se reemplazan por M418 y A579 en el modelo humano. El complejo MT de los vertebrados también dota a las células ciliadas de permeabilidad a las moléculas orgánicas, incluido el tinte FM1–4347. Aunque nuestra estructura no proporciona información directa sobre la vía de permeación de moléculas pequeñas, varias grietas hidrofóbicas, incluido el espacio revestido de lípidos entre TMC-1 y TMIE, proporcionan posibles rutas para el paso transmembrana de moléculas pequeñas como FM1-43.

Observamos una segunda conformación del complejo TMC-1 mediante clasificación 3D, denominada conformación C (Datos ampliados, figura 9). Las subunidades TMC-1 en las conformaciones E y C tienen una estructura general similar, y ambas incluyen canales iónicos cerrados. Sin embargo, en la conformación C, la hélice TM10 está doblada aproximadamente 9° en comparación con la conformación E, y hay una vuelta helicoidal adicional de TM10 en la conformación E. Al superponer sucesivamente las subunidades TMC-1 de los complejos C y E, observamos que en el estado E, cada mitad del complejo TMC-1, compuesto por las subunidades TMC-1, CALM-1 y TMIE, gira alrededor de 8 ° en comparación con el estado C, mediante un eje de rotación que se ubica cerca de las hélices H7 y H8 de TMC-1 y está orientado aproximadamente paralelo a la membrana. El movimiento de cada mitad del complejo (cuando se ve en paralelo al plano de la membrana) se asemeja al movimiento de un acordeón, y las regiones citoplasmáticas del complejo experimentan desplazamientos conformacionales relativamente mayores en comparación con las del lado extracelular de la membrana. De hecho, al comparar los estados C y E, las hélices anfipáticas TMC-1 H3 se separan aproximadamente 11 Å, lo que subraya la magnitud del cambio conformacional. Como se describe a continuación, estos cambios van acompañados de alteraciones significativas en la estructura y el comportamiento mecánico de la membrana que rodea la proteína (Datos ampliados, Fig. 9). Sin embargo, serán necesarios más estudios para determinar sus ramificaciones sobre la función del complejo MT. Sin embargo, estos resultados ilustran la plasticidad conformacional del complejo TMC-1 y, recíprocamente, la posibilidad de que las deformaciones de la membrana puedan inducir cambios conformacionales en el complejo TMC-1.

Para comprender cómo interactúa el complejo TMC-1 con lípidos individuales, así como con la bicapa lipídica, realizamos simulaciones de dinámica molecular de todos los átomos y de grano grueso en los complejos E y C incrustados en membranas compuestas de fosfolípidos y colesterol (Datos extendidos). Figura 10a). El conjunto de átomos incluyó tres simulaciones independientes para cada estado conformacional de la proteína, lo que produjo un tiempo de muestreo colectivo de 6 μs, mientras que las ejecuciones de grano grueso se realizaron en parches de membrana más grandes, cada uno de los cuales incluía cuatro copias de TMC-1 en E o conformaciones C (Datos ampliados, figura 10a), y cada una simulada durante 10 μs, lo que da como resultado un tiempo de muestreo colectivo de 80 μs de interacciones lípido-proteína. El examen de la estructura de membrana equilibrada alrededor del complejo TMC-1 indica una penetración profunda y un anclaje de la hélice H3 anfipática en la valva citosólica de la bicapa (Fig. 5a, b). De acuerdo con los mapas de densidad crio-EM, las simulaciones muestran que los fosfolípidos y el colesterol ocupan la cavidad entre TMIE y TMC-1, y el colesterol se enriquece en las grietas cerca de las hélices TM10 relacionadas con la doble simetría en la subunidad TMC-1. interfaz, que juntos respaldan la importancia de los lípidos en la estructura y función del complejo (Datos ampliados, Fig. 10b, c). El complejo TMC-1 también distorsiona la bicapa de la membrana, promoviendo tanto el adelgazamiento como el engrosamiento de la membrana en su vecindad, con un adelgazamiento especialmente prominente de la valva citoplasmática dentro de la región de inserción de la hélice H3 (Fig. 5c y Datos ampliados Fig. 10d). Es de destacar que las conformaciones E y C generan distintos patrones de deformación de la membrana (Fig. 5c y Datos ampliados, Figs. 9b y 10d, e). En particular, la conformación E induce una distorsión de la membrana más pronunciada (engrosamiento y adelgazamiento) cerca de la proteína, lo que resulta en una propagación de la deformación de la membrana de mayor alcance (alrededor de 50 Å de la proteína) (Datos ampliados, Fig. 10d, e).

a, La simulación de dinámica molecular del complejo TMC-1 integrado en la membrana (conformación E) muestra la penetración de la hélice H3 en la bicapa lipídica. b, Los residuos clave que definen la naturaleza anfipática de la hélice H3 se muestran como barras. c, Patrones de espesor de las valvas de la membrana extracelular y citosólica promediados durante los últimos 500 ns de tres réplicas simuladas para la conformación E. El patrón para la conformación C se muestra en la figura 8 de datos ampliados. La sección transversal de la proteína se muestra en azul y la ubicación de la sección transversal se indica encima de los gráficos utilizando una representación de superficie del complejo TMC-1. d, Esquema que ilustra los mecanismos mediante los cuales las fuerzas directas o indirectas podrían transducirse a la activación de canales iónicos. Las flechas grises (derecha) muestran cómo la tensión de la membrana podría controlar directamente el complejo TMC-1 ejerciendo fuerza sobre TMIE. La fuerza indirecta como resultado de cambios en el espesor de la membrana podría afectar la posición de la hélice H3 incrustada en la membrana, modulando la activación del canal iónico.

Las estructuras moleculares del complejo TMC-1 revelan la identidad, la arquitectura y la asociación de membrana de subunidades clave centrales para la transducción mecanosensorial de vertebrados y C. elegans. El complejo doblemente simétrico en forma de acordeón contiene subunidades TMIE colocadas como mangos perpendiculares a la membrana y hélices anfipáticas TMC-1 H3 insertadas y paralelas al plano de la membrana, cada una de las cuales proporciona posibles mecanismos para la transducción directa o indirecta de fuerza al canal iónico. puerta, respectivamente. Las interacciones entre TMIE y TMC-1 están restringidas a los límites extracelulares e intracelulares de TMIE TM1, lo que da como resultado una gran cavidad intramembranosa entre las dos subunidades que, según nuestra hipótesis, está llena de moléculas de lípidos en un entorno de membrana plasmática. TMIE se coloca proximal a las supuestas hélices formadoras de poros TM4-8 (Fig. 2a), interactuando directamente con TMC-1 TM6 y TM8 a través de enlaces de hidrógeno y a través del grupo palmitoilo unido al residuo C44 de TMIE. La disposición de las subunidades se asemeja a un acordeón, con TMIE formando los mangos del instrumento. Especulamos que la fuerza aplicada a TMIE, ya sea a través de la membrana o mediante contactos directos con una subunidad auxiliar, luego se acopla a las hélices transmembrana formadoras de poros TMC-1, abriendo el poro para permitir la permeación de iones.

En los vertebrados, la protocadherina-15 transduce fuerza a las puntas de los estereocilios, abriendo el canal MT. Estudios anteriores han sugerido que la protocadherina-15 forma un complejo dimérico estable con LHFPL5 pero también interactúa con las subunidades TMC-1 y TMIE9,15,17,48,49, pero aún se desconoce cómo podría ocurrir esta interacción. Una posibilidad es que el dímero de procadherina-15 esté situado coincidiendo con el eje doble del complejo TMC-1, con hélices transmembrana de procadherina-15 rodeando las hélices TM10 de TMC-1. Este complejo dimérico simétrico cerrado permitiría transducir directamente la tensión de la protocadherina-15 al complejo TMC-1 a través de los contactos de la protocadherina-15 con las hélices de TM10. Alternativamente, los dímeros de protocadherina-15 podrían interactuar con las hélices de TMIE, con una subunidad de protocadherina interactuando con una única subunidad de TMIE, formando así un complejo abierto en el que la subunidad de protocadherina-15 desapareada podría interactuar con una subunidad de TMIE de otro complejo TMC-1 (Fig. .5d). Este modelo proporciona un mecanismo directo para la transducción de fuerza desde la protocadherina-15 a TMIE y luego al poro del canal iónico TMC-1 y proporciona un mecanismo para la agrupación de complejos TMC-150. Además de la transducción directa de fuerza, también especulamos que el H3 de la subunidad TMC-1 actúa como una paleta en la membrana que se mueve hacia arriba o hacia abajo a medida que la membrana se adelgaza o se espesa, proporcionando así un mecanismo para el acoplamiento de fuerza al canal a través de la membrana. Se necesitarán más estudios de las conformaciones de canales abiertos del complejo TMC-1 de C. elegans, además de las estructuras del complejo MT de vertebrados, para dilucidar más completamente los mecanismos de transducción de fuerzas. Sin embargo, estos complejos TMC-1 proporcionan un marco para los mecanismos estructurales del tacto en C. elegans y de la audición y el equilibrio en los vertebrados.

La cepa PHX2173 tmc-1 (syb2173) fue generada por SunyBiotech utilizando la edición del genoma CRISPR-Cas9 y se conoce como línea tmc-1::mVenus (Figura 1 complementaria). La secuencia TMC-1-mVenus-3×Flag se insertó antes del codón de parada del gen tmc-1 endógeno (Wormbase: T13G4.3.1). El genotipo se confirmó mediante PCR y los cebadores ER02-seq-s (ATTAGATCCCGCAAGAGAAT) y ER02-seq-a (AAGGTGATATGAACGAACCG), que se unen 452 pb en sentido ascendente y 408 pb en sentido descendente desde el sitio de inserción, respectivamente, para amplificar la región de interés. Posteriormente, el producto de la PCR se secuenció utilizando los cebadores ER02-mid-s (CATGAAGCAACACGACTTCT) y ER02-mid-a (TCTTCGATGTTGTGACGGAT), que se unen dentro de la secuencia TMC-1-mVenus-3×Flag. Para permitir la elución del complejo TMC-1 diseñado a partir de resina de cromatografía de afinidad, se colocó un sitio de escisión de proteasa PreScission (3C) entre el extremo C de TMC-1 y el fluoróforo mVenus.

Los gusanos adultos se inmovilizaron en tampón M9 (KH2PO4 22 mM, Na2HPO4 42 mM, NaCl 86 mM y MgCl2 1 mM) que contenía azida sódica 30 mM y se colocaron en portaobjetos que se prepararon con almohadillas de agar de ~4 mm. Las imágenes espectrales se adquirieron en un microscopio invertido Zeiss LSM 880 Fast Airyscan de 34 canales con una lente objetivo de inmersión en agua de 40 × 1,2 NA. Se empleó una separación lineal para distinguir entre la señal de mVenus y la autofluorescencia. La señal de autofluorescencia se restó de cada imagen. La información 3D z-stack se presenta en 2D después de realizar una proyección de máxima intensidad.

Todas las cepas de C. elegans se mantuvieron y cultivaron según los métodos de Wormbook (//www.wormbook.org). Para el cultivo líquido a gran escala, se prepararon placas de agar con medio de crecimiento de nematodos (NGM) y se esparcieron con la cepa HB101 de E. coli, permitiendo que el césped bacteriano creciera durante la noche a 37 °C. Los gusanos se transfirieron a las placas NGM y se cultivaron durante 3 a 4 días a 20 °C hasta que se agotaron las células HB101. Los gusanos en las placas se transfirieron a un medio líquido en matraces con pantallas de 2 litros, suplementados con HB101 (~15 g por 500 ml de medio) y estreptomicina (50 μg ml-1), y los gusanos se cultivaron a 20 °C con agitación vigorosa ( 150 rpm) durante 70-72 h. Para recolectar los gusanos, los matraces de cultivo líquido se colocaron en hielo durante 1 h para permitir que los gusanos se asentaran. Se retiró el medio y la suspensión de lombrices se recogió en un tubo, se lavó dos veces con 50 ml de tampón M9 enfriado con hielo mediante centrifugación sucesiva (800 g durante 1 min) y resuspensión. Los gusanos se "limpiaron" mediante centrifugación por densidad de sacarosa a 1500 g durante 5 minutos después de aumentar el volumen de la suspensión de gusanos a 25 ml con tampón M9 y agregar 25 ml de sacarosa al 60% (p/v) helada. La capa de gusano en la parte superior se recuperó y se colocó en un tubo nuevo y luego se lavó dos veces con 50 ml de tampón M9 enfriado con hielo. Se midió el volumen del sedimento de lombrices y se añadió el mismo volumen de tampón M9 al tubo y se fabricaron bolas de lombrices goteando la suspensión en nitrógeno líquido. Las bolas de gusano se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.

Se rompieron aproximadamente 80 g de bolas de gusano congeladas usando un molino de bolas (MM400, Retch) donde el recipiente de molienda y la bola se enfriaron previamente en nitrógeno líquido. El polvo de gusano disgregado se solubilizó a 4 °C durante 2 h en un tampón que contenía Tris-Cl 50 mM (pH 9,3), NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, glicodiosgenina (GDN) al 2 % (p/v) y proteasa. inhibidores (aprotinina 0,8 µM, leupeptina 2 µg ml-1 y pepstatina 2 µM). Después de la centrifugación a 40.000 rpm (186.000 g) durante 50 minutos, el sobrenadante se aplicó a una resina de afinidad anti-Flag M2 (A2220, Sigma-Aldrich) y se incubó durante la noche en un rotador a 4 °C. La resina se lavó 5 veces con un tampón que contenía Tris-Cl 20 mM (pH 8,5), NaCl 150 mM y GDN al 0,02 % (p/v), utilizando un volumen de tampón que era 200 veces el volumen de la resina. El complejo TMC-1 se eluyó incubando con 40 μg de proteasa 3C a 4 °C durante 4 h en el rotador. Posteriormente, la solución se complementó con CaCl2 3 mM, concentración final, y el eluato se filtró con un filtro de tubo de centrífuga de 0,22 µm. El concentrado se cargó en una columna SEC (Superose 6 Incremento 10/30 GL, GE Healthcare), se equilibró en un tampón compuesto por Tris-Cl 20 mM (pH 8,5), NaCl 150 mM, GDN al 0,02 % (p/v) y CaCl2 3 mM. Las fracciones máximas del supuesto complejo dimérico TMC-1 se combinaron y concentraron para la preparación de la rejilla crio-EM. Se aislaron aproximadamente 50 ng de TMC-1 de 80 g de bolas de gusanos, lo que se traduce en aproximadamente 6 × 107 gusanos. La cantidad de proteína se determinó mediante fluorescencia de mVenus basándose en un gráfico estándar. La cantidad total estimada del complejo TMC-1, incluidos TMC-1, CALM-1 y TMIE, es de 60 ng. La muestra de TMC-1 nativa aislada se analizó mediante SDS-PAGE y las bandas de proteínas se visualizaron mediante tinción con plata. Para el análisis de espectrometría de masas, el supuesto pico del complejo dimérico TMC-1 se reunió y se concentró hasta un volumen de 50 µl para su uso posterior. Se utilizó el mismo método de aislamiento para preparar la muestra de gusano de tipo salvaje de la cepa N2 de C. elegans para usarla como control en los experimentos de espectrometría de masas con el fin de evaluar la unión no específica de las proteínas de C. elegans a la afinidad anti-Flag M2. resina.

El complejo TMC-1 nativo, unido a una resina de afinidad anti-Flag M2, se eluyó con un tampón que comprendía Tris-Cl 20 mM (pH 8,5), NaCl 150 mM y GDN al 0,02% (p/v), suplementado con 1 mg ml-1. −1 2 × Péptido bandera a 4 ° C durante 40 min en un rotador. El eluato se concentró y se sometió a purificación adicional en una columna SEC. El supuesto pico del complejo dimérico TMC-1 se combinó y se utilizó para SiMPull.

Los cubreobjetos y los portaobjetos de vidrio se limpiaron, pasivaron y recubrieron con una solución que consistía en metoxipolietilenglicol (mPEG) 50 mM y PEG biotinilado 1,25 mM en agua. Se creó una cámara de flujo perforando orificios de 0,75 mm en un portaobjetos de cuarzo y colocando cinta adhesiva de doble cara entre los orificios. Se colocó un cubreobjetos encima del portaobjetos y los bordes se sellaron con epoxi, creando pequeñas cámaras de flujo. Luego se aplicó al portaobjetos una solución de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que incluía 0,25 mg ml-1 de estreptavidina, se dejó incubar durante 5 minutos y se lavó con un tampón que consistía en Tris 50 mM, NaCl 50 mM y 0,25 mg ml-1. −1 albúmina sérica bovina (BSA), pH 8,0 (tampón BSA T50). Se aplicó al portaobjetos un nanocuerpo anti-GFP biotinilado en T50 BSA a 10 µg ml-1, se dejó incubar durante 10 minutos y se lavó con 30 µl de tampón A (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, 0,02 % ( p/v) GDN, CaCl2 3 mM).

El complejo TMC-1 se aisló como se describe en "Aislamiento del complejo TMC-1 nativo para SiMPull". El complejo se purificó mediante SEC, se diluyó 1:200 y se aplicó inmediatamente a la cámara. Después de una incubación de 5 minutos, el portaobjetos se lavó con 30 µl de tampón A y se tomaron imágenes de la cámara utilizando un microscopio TIRF Leica DMi8 con un objetivo de inmersión en aceite de 100 ×. Las imágenes se capturaron utilizando una cámara EMCCD retroiluminada (Andor iXon Ultra 888) con un área de imagen de 133 × 133 µm y un tamaño de píxel de 13 µm. Este tamaño de píxel de 13 µm corresponde a 130 nm en la muestra debido al objetivo de 100 ×. Para estimar la unión no específica al portaobjetos de vidrio, el complejo TMC-1 purificado se aplicó a una cámara separada en la que no se incluyó el nanocuerpo anti-GFP y los demás pasos permanecieron idénticos. El recuento de puntos observados en esta cámara se utilizó para estimar el número de puntos de fluorescencia de fondo.

Las películas de fotoblanqueo se adquirieron exponiendo el área de imagen durante 60 s. Para contar el número de subunidades de TMC-1, se generaron trazas de tiempo de fluorescencia de una sola molécula del complejo TMC-1 etiquetado con mVenus utilizando un script de Python personalizado. Cada rastro se calificó manualmente como si tuviera de uno a tres pasos de blanqueo o se descartó si no se podían identificar pasos de blanqueo limpios. La distribución resultante de los pasos de blanqueo coincide estrechamente con una distribución binomial para una proteína dimérica basada en una maduración estimada de GFP del 80%. Se evaluaron un total de 600 moléculas a partir de 3 películas distintas. La puntuación se verificó evaluando la intensidad del spot; en promedio, las moléculas que blanquean en dos pasos eran dos veces más brillantes que las que blanquean en un solo paso.

La muestra del complejo TMC-1 purificado se secó, se disolvió en dodecilsulfato de sodio al 5 %, urea 8 M, glicina 100 mM (pH 7,55), se redujo con (tris(2-carboxietil)fosfina a 37 °C durante 15 min, se alquiló con metanotiosulfonato de metilo durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición de metanol acidificado al 90% y tampón de bicarbonato de trietilamonio 100 mM (TEAB; pH 7,55). Luego, la muestra se digirió brevemente en una microcolumna S-trap con 2 µg de Tryp/LysC. mezcla de proteasa, seguido de un lavado y 2 h de digestión a 47 °C con tripsina. Los péptidos se eluyeron con TEAB 50 mM y 50 % de acetonitrilo, 0,2 % de ácido fórmico, se reunieron y se secaron. Cada muestra se disolvió en 20 µl de 5 % de ácido fórmico y se inyectó en un espectrómetro de masas Thermo Fisher QExactive HF. Los digestos de proteínas se separaron mediante cromatografía líquida con un sistema Dionex RSLC UHPLC y luego se entregaron a un QExactive HF (Thermo Fisher) mediante ionización por electropulverización con una fuente de pulverización de iones Nano Flex (Thermo Fisher). equipado con una punta rociadora emisora ​​de nanodiámetro de acero inoxidable de 20 um y un voltaje de fuente de 1,0 kV. Para controlar el sistema se utilizó Xcalibur versión 4.0. Las muestras se aplicaron a 10 µl min-1 a un cartucho trampa Symmetry C18 (Waters) durante 10 minutos, luego se cambiaron a una columna NanoAcquity BEH 130 C18 de 75 µm x 250 mm con partículas de 1,7 µm (Waters) usando fases móviles de agua (A). y acetonitrilo (B) que contiene ácido fórmico al 0,1 %, un gradiente de acetonitrilo del 7,5 al 30 % durante 60 min y un caudal de 300 nl min-1. Los espectros de masas de estudio se adquirieron en m/z 375–1400 con una resolución de 120 000 (m/z 200) y la adquisición dependiente de los datos seleccionó los 10 iones precursores más abundantes para la espectrometría de masas en tándem mediante disociación por colisión de mayor energía utilizando un ancho de aislamiento de 1,2 m. /z, energía de colisión normalizada de 30 y una resolución de 30.000. La exclusión dinámica se configuró en automática, estado de carga para MS/MS de +2 a +7, tiempo máximo de iones de 100 ms, objetivo de AGC mínimo de 3 × 106 en modo MS1 y 5 × 103 en modo MS2. El análisis de datos se realizó utilizando Comet (v. 2016.01, rev. 3)51 frente a una versión de enero de 2022 de la base de datos canónica de proteínas FASTA que contiene secuencias UniProt de C. elegans y entradas concatenadas de secuencias invertidas para estimar los umbrales de error y 179 secuencias de contaminantes comunes y sus secuencias invertidas. formas. Comet busca todas las muestras realizadas con especificidad de la enzima tripsina con una tolerancia de masa de ion monoisotópico principal establecida en 1,25 Da y una tolerancia de masa de ion de fragmento monoisotópico establecida en 1,0005 Da. Se añadió una modificación estática de +45,9877 Da a todos los residuos de cisteína y una modificación variable de +15,9949 Da a los residuos de metionina. Se utilizó una transformación discriminante lineal para mejorar la sensibilidad de identificación del análisis Comet52,53. Se crearon histogramas separados para coincidencias con secuencias directas y para coincidencias con secuencias invertidas para todos los péptidos de siete aminoácidos o más. Los histogramas de puntuación de coincidencias invertidas se utilizaron para estimar las tasas de descubrimiento falso de péptidos (FDR) y establecer umbrales de puntuación para cada clase de péptido. El FDR de proteína global fue del 1,2%.

Se aplicó un volumen de 3,5 µl del complejo TMC-1 concentrado a una rejilla Quantifoil (malla de oro R2/1 300, cubierta por una película de carbono continua de 2 nm), que se descargó luminiscentemente a 15 mA durante 30 s en presencia de amilamina. . Las rejillas se secaron y se congelaron instantáneamente usando un Vitrobot mark IV durante 2,5 s con 0 fuerza de transferencia después de un tiempo de espera de 30 s con 100% de humedad a 15 °C. Las rejillas se congelaron en etano líquido y se enfriaron con nitrógeno líquido.

El conjunto de datos del complejo TMC-1 nativo se recopiló en un microscopio FEI Titan Krios de 300 keV equipado con un detector K3. Las micrografías se adquirieron en modo de superresolución (0,4195 Å por píxel) con un aumento de 105.000 × correspondiente a un tamaño de píxel físico de 0,839 Å por píxel. Las imágenes se recolectaron mediante un método de 3 × 3 orificios múltiples por cambio de etapa y un método de 6 disparos múltiples por orificio utilizando Serial EM, con un rango de desenfoque de −1,0 a −2,4 µm. Cada pila de películas se expuso durante 3,3 segundos y constaba de 50 fotogramas por película, con una dosis total de 50 e− Å−2. Se recopilaron un total de 26.055 películas.

El movimiento inducido por el haz se corrigió mediante corrección de movimiento de parche con un factor de recorte de Fourier de salida de 1/2 (0,839 Å por píxel). Los parámetros de la función de transferencia de contraste (CTF) se estimaron mediante la estimación del parche CTF en CryoSparc v3.3.154. Se seleccionaron un total de 25.852 películas mediante curación manual y las partículas se recogieron utilizando un selector de partículas con diámetros de partícula mínimo y máximo de 140 Å y 200 Å, respectivamente. Inicialmente, se recogieron y extrajeron 7,9 millones de partículas con un tamaño de caja de 400 píxeles y se agruparon 4 veces (3,356 Å por píxel). Después de una ronda de clasificación 2D, se eliminaron las partículas "basura", lo que dio como resultado 3,2 millones de partículas en total. Las partículas con características de mayor resolución, aproximadamente 1,5 millones, se utilizaron para la reconstrucción ab initio. A continuación, la pila completa de partículas, compuesta por 3,2 millones de partículas de clasificación 2D, se sometió a un refinamiento heterogéneo utilizando los modelos reconstruidos a partir de la reconstrucción ab initio. En este paso se eliminaron posibles complejos monoméricos de TMC-1, micelas de detergente y partículas basura adicionales, lo que produjo 1,65 millones de partículas. Luego se volvieron a extraer partículas de imágenes no agrupadas. Posteriormente, se realizó un refinamiento heterogéneo utilizando simetría C1 con los 1,65 millones de partículas reextraídas, dando como resultado 8 clases. Entre ellas, se seleccionaron y utilizaron para análisis posteriores tres buenas clases compuestas por 667.000 partículas. Después de una ronda de refinamiento heterogéneo con 4 clases en simetría C2, se discernieron dos clases que contenían 208.000 y 199.000 partículas, cada una con características distintas y que describimos como formas contraídas y expandidas, respectivamente. Se realizó una ronda más de refinamiento heterogéneo para ambas pilas de partículas para separar grupos de partículas homogéneas de cada clase. Para lograr una resolución más alta y una calidad de mapa mejorada, se realizó un refinamiento no uniforme que incluye desenfoque y refinamiento CTF global en Cryosparc v3.3.1 de cada clase individual, con tamaños de pila de partículas de 141 000 (contraído) y 142 000 (expandido), lo que da como resultado resoluciones de 3,09 Å y 3,10 Å, respectivamente.

Entre las ocho clases iniciales del refinamiento heterogéneo de 1,65 millones de partículas, una de las clases, que contenía 272.000 partículas, tenía una característica de densidad adicional, próxima a CALM-1. Con esta clase se llevó a cabo un mayor refinamiento heterogéneo y clasificación 3D sin alineación para clasificar partículas heterogéneas. Una ronda más de refinamiento heterogéneo en Cryosparc dio como resultado una clase de partículas prometedora, que contiene 99.000 partículas, de un total de cuatro clases. Se realizó un refinamiento no uniforme, incluido el desenfoque y el refinamiento CTF global, con la clase seleccionada, lo que dio como resultado un mapa con una resolución de 3,54 Å. Para mejorar la densidad de la proteína desconocida unida a CALM-1, se realizó un refinamiento local en Cryosparc utilizando una máscara que cubría la "densidad extra" y CALM-1.

El mapa de densidad de microscopía electrónica inicial se afiló con Phenix AutoSharpen55, y se utilizaron mapas afilados y no afilados para la determinación de la estructura. Para la construcción del modelo se utilizaron varias estrategias, incluida la construcción de novo, la predicción de estructuras, el acoplamiento y el modelado homólogo. Las hélices transmembrana de TMC-1 (TM1-TM9, excluyendo TM10), predichas por Alphafold256 como plantilla, se ajustaron al mapa con ajuste de cuerpo rígido en UCSF Chimera57 y construcción de modelos de novo utilizando Coot58. El posible poro de permeación de iones del canal se determinó mediante MOLE 2.059. Los grupos de carbohidratos se modelaron con densidades sobresalientes de N209 en TMC-1, en un sitio de glicosilación ligada a N predicho.

Para construir la estructura de CALM-1 en el mapa de densidad de conformación expandida del complejo TMC-1, explotamos la estructura previamente determinada de CIB3 en complejo con un péptido TMC-1 (ID del banco de datos de proteínas: 6WUD). Conectamos CIB3 al mapa de densidad usando un ajuste de cuerpo rígido en UCSF Chimera, usando las hélices H5 y H6 altamente conservadas de TMC-1 como guía, y procedimos introduciendo la secuencia de CALM-1 en el modelo, seguido del ajuste manual de el modelo usando Coot. Las voluminosas cadenas laterales conservadas, incluidas F84, Y129 y F197, que sobresalen en cavidades hidrófobas y están orientadas hacia las hélices de TMC-1, facilitaron la definición del registro correcto de la secuencia CALM-1.

La subunidad auxiliar, TMIE, se incorporó manualmente en el mapa de densidad de la conformación expandida utilizando Coot. La voluminosa densidad de la cadena lateral del triptófano (W25) y la modificación de los lípidos en el residuo de cisteína (C44) ayudaron a asignar el registro de secuencia en el contexto del mapa de densidad. El modelo fue refinado contra el mapa mejorado mediante el refinamiento del espacio real en Phenix.

Las siguientes regiones de TMC-1 no se modelaron en el mapa debido a densidades débiles o ausentes: La región N-terminal de TMC-1 (M1 a P73), la región del bucle predicha entre TM5 y TM6 (S460 a N663) y la Región C-terminal (L886 a D1285). Las cadenas laterales con densidad débil en las hélices H1 (75–87) y TM10 (870–885) se modelaron como residuos de alanina. La región N-terminal de CALM-1, de los residuos 1 a 17, y los aminoácidos de TMIE, incluidos 1–17 y 64–117, no se modelaron debido a una falta de densidad. Como se analiza en el texto principal, sugerimos que los residuos 1 a 17 de TMIE comprendan un péptido señal.

Para el modelado de la densidad desconocida en CALM-1, especulamos que ARRD-6 era una posible proteína auxiliar candidata según los resultados de la espectrometría de masas. Aunque la calidad general del mapa de la supuesta región ARRD-6 no fue suficiente para la construcción del modelo de novo, pudimos encontrar varias hojas β con densidades de cadenas laterales en el mapa. Usando la estructura predicha de ARRD-6 y la protrusión cruzada de dos bucles de los dominios N y C de arrestina (82–85 del dominio N y 249–256 del dominio C), podríamos alinear el ARRD predicho -6 en la densidad desconocida, proporcionando así más evidencia de que la densidad desconocida es ARRD-6. La resolución local estimada de la densidad de ARRD-6 oscila entre 4 y 7 Å y la puntuación Q calculada del modelo a mapa ARRD-6 del complemento MapQ60 en Chimera es 0,25, lo que corresponde a la resolución estimada de 4,91 Å, lo que sugiere que el modelo está razonablemente ubicado en el mapa. El CC final del ARRD-6 y del modelo general es 0,42 y 0,69, respectivamente. Todas las cifras para mapas y modelos de densidad fueron generadas por Pymol y ChimeraX.

Se realizaron simulaciones de dinámica molecular en las conformaciones C y E y en dos resoluciones diferentes, de grano grueso (CG) y de todos los átomos (AA). A partir de la estructura modelada crio-EM, se modelaron un grupo de tapa carboxílico C-terminal, un grupo de tapa de amonio N-terminal, cadenas laterales faltantes y todos los átomos de hidrógeno utilizando el complemento PSFGEN de VMD61. Se empleó PROPKA para estimar el pKa de los residuos titulables62,63. Todas las cadenas laterales titulables se encontraron en su estado de protonación predeterminado. Luego, las estructuras modeladas se utilizaron para configurar las simulaciones CG y AA.

Los modelos CG basados ​​en Martini64,65,66 de los complejos TMC-1 se generaron empleando el protocolo Martinize como se describe en el sitio web de Martini (http://www.cgmartini.nl/), seguido de la aplicación de una red elástica en el átomo. pares dentro de un límite de 10 Å. Los parámetros de CG para Cys palmitoilado en TMIE se obtuvieron de un trabajo previo67. La orientación inicial de la proteína en la membrana se adoptó de la base de datos de orientaciones de proteínas en membranas (OPM). Luego, los complejos proteicos se insertaron en una bicapa lipídica compuesta de palmitoil-oleoil-fosfatidil-etanolamina (PE), palmitoil-oleoil-fosfatidil-colina (PC), esfingomielina (SM) y colesterol con una proporción molar de 54:32: 8:6. La esfingomielina utilizada en las simulaciones de CG fue el lípido DPSM en la jerga de Martini, correspondiente a las colas de C(d18:1/18:0)N-estearoil-d-eritro. En las simulaciones de AA, la esfingomielina era PSM en el campo de fuerza CHARMM correspondiente a N-palmitoil-esfingomielina (PSM). Las estructuras secundarias de las proteínas se derivaron de los modelos AA y se mantuvieron durante las simulaciones CG. Para mejorar el muestreo y las estadísticas, se incrustaron cuatro copias de la proteína en cada conformación en un parche grande (400 × 400 Å2) de bicapa lipídica a una distancia entre proteínas de 200 Å, utilizando el programa informático Insane68. Luego, los sistemas se solvataron e ionizaron con NaCl 150 mM empleando Insane (tamaño del sistema: 330.000 perlas CG).

Los complejos proteína-membrana equilibrados en CG después de 8 μs de simulaciones de CG se reasignaron a modelos AA basados ​​en CHARMM, empleando CHARMM-GUI69,70, seguido del aislamiento de una de las cuatro réplicas (una copia de proteína con un acolchado de membrana de aproximadamente 40 Å) del parche de membrana más grande. Se utilizó DOWSER para hidratar internamente la proteína71,72. Luego, los sistemas de proteína-membrana se solvataron con agua, incluido NaCl 150 mM en VMD (tamaño del sistema: 340.000 átomos). Para mejorar las estadísticas y reducir aún más cualquier sesgo de la colocación inicial de lípidos, se generaron tres sistemas de membrana independientes, con lípidos iniciales colocados de forma independiente, para cada conformación utilizando el complemento Membrane Mixer (MMP)73.

Los sistemas CG se simularon utilizando GROMACS74, con los parámetros de simulación estándar Martini v2.266. Las simulaciones se realizaron con un paso de tiempo de 20 fs. La temperatura se fijó en 310 K usando un termostato de reescalado de velocidad75 con una constante de tiempo de 1 ps para el acoplamiento. El barostato Berendsen76 mantuvo una presión semiisotrópica de 1 bar con una compresibilidad de 3 × 10-4 bar y una constante de tiempo de relajación de 5 ps. Inicialmente, se minimizó la energía de los sistemas durante 1000 pasos, seguidos de ejecuciones de relajación de 18 ns, mientras que los grupos principales de la bicapa lipídica y las cadenas principales de proteínas se restringieron armónicamente. Durante los 18 ns iniciales, las restricciones aplicadas a los grupos de cabeza bicapa se eliminaron paso a paso (de k = 200 kJ mol-1 nm-2 a cero), mientras que las restricciones en la columna vertebral de la proteína (k = 1000 kJ mol-1 nm-2) se mantuvieron sin cambios. Luego se simularon los sistemas de 4 proteínas en cada conformación durante 10 μs, con restricciones aplicadas solo a las cadenas principales de proteínas, lo que resultó en un muestreo acumulativo de 80 μs (4 copias × 2 conformaciones × 10 μs).

Los sistemas convertidos en AA se simularon utilizando el siguiente protocolo: (1) 5.000 pasos de minimización, seguidos de 5 ns de relajación, durante los cuales los átomos pesados ​​de las proteínas, así como los iones Ca2+ unidos, se restringieron armónicamente (k = 10 kcal mol- 1 Å-2) a su posición en el modelo crio-EM; (2) 1 ns de equilibrio con restricciones armónicas solo en los átomos pesados ​​de la columna vertebral de la proteína (k = 10 kcal mol−1 Å−2). La coordinación de los iones Ca2+ en este paso se mantuvo mediante la aplicación del algoritmo de enlaces adicionales en NAMD77,78, (3) 200 ps de equilibrio durante el cual se mantuvieron las restricciones en la columna vertebral mientras que se eliminaron los enlaces adicionales en los iones Ca2+; (4) se generaron dos réplicas adicionales con el complemento MMP y se realizaron ejecuciones de producción de 1 μs en cada una de las tres réplicas de simulación independientes, mientras que solo se restringieron los átomos pesados ​​de la columna vertebral de la proteína. Los pasos 1 a 3 se realizaron utilizando NAMD277,78. Las corridas de producción de 1 μs para las tres réplicas se realizaron en Anton279.

Todas las simulaciones de AA se realizaron utilizando los campos de fuerza totalmente atomísticos CHARMM36m80 y CHARMM3681 para las proteínas y lípidos, respectivamente. Las moléculas de agua se modelaron con TIP3P82. En las simulaciones NAMD, se utilizó un límite de 12 Å para interacciones no enlazadas de corto alcance, con una distancia de conmutación a partir de 10 Å. Se utilizó la malla de partículas Ewald (PME) para calcular interacciones electrostáticas de largo alcance83 con una densidad de rejilla de 1 Å-1 y un orden de interpolación PME de 6. Se utilizó el algoritmo SHAKE para restringir los enlaces que involucran átomos de hidrógeno84. La temperatura se mantuvo constante a 310 K utilizando un termostato Langevin con un coeficiente de amortiguación de 1,0 ps-1. La presión se mantuvo a 1 atm empleando el barostato de pistón Nosé-Hoover Langevin con período y caída de 100 y 50 fs, respectivamente85,86. Todos los sistemas se simularon en una celda flexible permitiendo que las dimensiones de la celda periódica cambiaran de forma independiente mientras se mantenía constante la relación de aspecto en el plano xy (plano de membrana). El paso de tiempo se estableció en 2 fs, y las fuerzas PME y Lennard-Jones se actualizaron cada dos y en cada paso de tiempo, respectivamente.

Para las simulaciones de Anton2, el acoplamiento de cadena Nosé-Hoover y los esquemas Martyna-Tuckerman-Klein85 mantuvieron una temperatura de 310 K y una presión de 1 bar, implementados mediante un esquema multigrator87. Se utilizó M-SHAKE para restringir todos los enlaces a átomos de hidrógeno88, y en todas las simulaciones se utilizó un paso de tiempo de 2,5 fs. Las interacciones electrostáticas de largo alcance se calcularon empleando el método de transformada rápida de Fourier (FFT) en Anton279.

El efecto de la proteína sobre el espesor de cada valva de la membrana se cuantificó en simulaciones CG y AA monitoreando la distancia z (membrana normal) de los grupos fosfato de los fosfolípidos con respecto al plano medio de la bicapa, durante la segunda mitad de cada trayectoria ( últimos 5 μs de las simulaciones CG o los últimos 500 ns de las simulaciones AA). Los valores de espesor se trazaron utilizando un histograma con 2 × 2 contenedores Å2 en el plano xy (plano de membrana), para cada valva individualmente. Las distribuciones de colesterol y fosfolípidos se calcularon de manera similar sumando las posiciones de las perlas de hidroxi (para colesterol) o fosfato (para fosfolípidos) en los últimos 5 μs de las trayectorias del CG en histogramas.

Primero, se determinaron los recuentos de lípidos individuales para todas las especies de lípidos dentro de 7 Å (usando perlas de fosfato de fosfolípido o hidroxilo de colesterol) de las cuatro copias de proteínas durante los 10 μs de la simulación CG. Luego se definió un índice de agotamiento-enriquecimiento para el lípido tipo L utilizando la siguiente ecuación89:

donde ratio(L)7A es el número de moléculas de lípido tipo L dentro de 7 Å de copias de proteína como fracción del número total de moléculas de lípidos dentro de 7 Å de copias de proteína, y ratio(L)bulk es el número de moléculas de lípido tipo L en la membrana como fracción del número total de moléculas de lípidos en la membrana.

La estructura crio-EM de la conformación E del complejo TMC-1 de C. elegans (que contiene seis cadenas: dos TMC-1, dos CALM-1 y dos TMIE) se utilizó como plantilla para construir un modelo de homología de TMC-1 humano. complejo. Se aisló cada cadena en la estructura plantilla y su secuencia se alineó con la secuencia humana correspondiente con AlignMe90. Luego, las secuencias alineadas se utilizaron en la capacidad de cadenas múltiples de MODELLER91 para generar un complejo TMC-1 humano. Se utilizaron los métodos de energía proteica discreta optimizada (DOPE)92 y GA34193,94 para evaluar la calidad del modelo generado. La optimización se realizó con una iteración máxima de 300 y se seleccionó el modelo con la mejor función de densidad de probabilidad molecular (molpdf) (Datos extendidos, Fig. 7). Todo el ciclo de optimización se repitió dos veces para obtener una mejor estructura.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Las coordenadas y los volúmenes de los datos crio-EM se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica con los códigos de acceso EMD-26741 (conformación expandida), EMD-26742 (conformación contraída) y EMD-26743 (con ARRD-6). Las coordenadas se han depositado en el Banco de datos de proteínas con los códigos de acceso 7USW (conformación expandida), 7USX (conformación contraída) y 7USY (con ARRD-6). Todas las instantáneas iniciales y finales de las trayectorias de la dinámica molecular, así como los parámetros de simulación y los archivos de configuración están depositados en https://doi.org/10.5281/zenodo.6780283.

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Descargar referencias

Agradecemos a T. Nicolson, P. Barr-Gillespie, D. Farrens, M. Mayer, A. Aballay, J. Ge, J. Elferich y miembros de los laboratorios Gouaux y Baconguis por sus útiles debates; S. Petrie y B. Jenkins por su ayuda con las imágenes espectrales de gusanos; T. Provitola por su ayuda con las figuras; A. Reddy para análisis espectrométrico de masas; J. Meyers y S. Yang por su ayuda con la detección crio-EM y la recopilación de datos; A. Chinn por su ayuda con el crecimiento de lombrices; y R. Hallford por la corrección de pruebas. Las rejillas crio-EM iniciales se examinaron en el Centro Cryo-EM del Noroeste del Pacífico (PNCC), que cuenta con el apoyo de la subvención U24GM129547 de los NIH y se realizaron en el PNCC en OHSU, al que se accede a través de EMSL (grid.436923.9), una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del DOE. patrocinado por la Oficina de Investigaciones Biológicas y Ambientales. El gran conjunto de datos crio-EM de una sola partícula se recopiló en el Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes (HHMI). El recurso compartido de proteómica de OHSU cuenta con el apoyo parcial de las subvenciones principales de los NIH P30EY010572 y P30CA069533. Este trabajo fue apoyado por la subvención 1F32DC017894 del NIH a SC. Las simulaciones fueron respaldadas por las subvenciones del NIH, P41-GM104601 y R01-GM123455 para ET. Las simulaciones se realizaron utilizando asignaciones en Anton en el Centro de Supercomputación de Pittsburgh (premio MCB100017P a ET), y se proporcionaron recursos XSEDE. por los Centros de Supercomputación de la Fundación Nacional de Ciencias (subvención XSEDE número MCA06N060 a ET). EG agradece el apoyo de J. LaCroute y B. LaCroute, y es investigador del HHMI.

Estos autores contribuyeron igualmente: Hanbin Jeong, Sarah Clark

Instituto Vollum, Universidad de Ciencias y Salud de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

Hanbin Jeong, Sarah Clark, April Goehring y Eric Gouaux

Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de Ciencias y Salud de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

Abril Goehring y Eric Gouaux

Grupo de Biofísica Teórica y Computacional, Centro NIH de Modelado Macromolecular y Bioinformática, Instituto Beckman de Ciencia y Tecnología Avanzada, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana, IL, EE. UU.

Sepehr Dehghani-Ghahnaviyeh, Ali Rasouli y Emad Tajkhorshid

Departamento de Bioquímica, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana, IL, EE. UU.

Sepehr Dehghani-Ghahnaviyeh, Ali Rasouli y Emad Tajkhorshid

Centro de Biofísica y Biología Cuantitativa, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana, IL, EE. UU.

Sepehr Dehghani-Ghahnaviyeh, Ali Rasouli y Emad Tajkhorshid

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HJ, SC y AG realizaron los experimentos. HJ, SC y AG, junto con EG, diseñaron el proyecto y escribieron el manuscrito. SD-G., AR y ET realizaron y analizaron simulaciones de dinámica molecular. Todos los autores contribuyeron a la preparación del manuscrito.

Correspondencia a Eric Gouaux.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Eduardo Perozo y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Imagen confocal espectral de la fluorescencia de mVenus en un gusano adulto tmc-1::mVenus que muestra la fluorescencia de mVenus en las neuronas de la cabeza, los cilios y los músculos de la pared corporal. Se muestra una imagen representativa de cinco imágenes en total. b, perfil FSEC representativo del complejo TMC-1, detectado mediante la etiqueta mVenus. El recuadro muestra un gel SDS-PAGE teñido con plata del complejo TMC-1 purificado. El asterisco rojo indica TMC-1. Los experimentos se repitieron dos veces con resultados similares. Se utilizaron tiroglobulina (669 kDa) y apo ferritina (443 kDa) como estándares de masa molecular de proteínas. c, La distribución de los pasos de fotoblanqueo de mVenus para el complejo TMC-1 es consistente con una función binomial (barras grises) y un ensamblaje con dos fluoróforos. Se analizaron un total de n = 600 puntos de tres películas de fotoblanqueo (200 puntos por película) en ubicaciones aleatorias de la cámara de imágenes. Cada película está representada por un punto azul. d, Se muestran imágenes del complejo TMC-1 etiquetado con mVenus purificado por SEC capturado con nanocuerpo anti-GFP biotinilado. Barra de escala = 5 µm. e, Trazo representativo que muestra el fotoblanqueo en dos pasos (flechas rojas) del complejo TMC-1 etiquetado con mVenus.

a, Las proteínas detectadas por EM, a través de sus fragmentos peptídicos asociados, se enumeran con su nombre genético y masa molecular. También se indica el número de péptidos únicos identificados tanto del complejo TMC-1 nativo como de gusanos de tipo salvaje (C. elegans N2), utilizados como control. b, Se muestran la secuencia de aminoácidos y la estructura secundaria de C. elegans TMC-1. La estructura secundaria basada en la estructura crio-EM se indica encima de las secuencias como cilindros (hélices α), líneas negras (regiones de bucle) o líneas discontinuas (residuos desordenados). Las líneas rojas sobre las secuencias indican péptidos de C. elegans encontrados por EM. . Tenga en cuenta que los segmentos TMC-1, correspondientes a la secuencia de 13–33, 557–566, 567–587, 877–890, 897–904, 917–927, 972–996, 1041–1052, 1177–1190, 1192 –1216 y 1261–1269 también se encuentran en MS, pero no se indican en b.

Diagrama de flujo para el análisis de datos crio-EM de la conformación E y C del complejo TMC-1.

Diagrama de flujo para el análisis de datos crio-EM del complejo TMC-1 con ARRD-6.

a, Una micrografía crio-EM representativa del complejo TMC-1 junto con varias clases 2D de cada clase 3D principal. Cada círculo de diferente color (verde, rojo y azul) en la micrografía indica partículas que se clasificaron en cada conformación: expandida, contraída y con ARRD-6, respectivamente. Barra de escala = 200 Å. b, Distribuciones angulares de reconstrucciones finales. c, Mapa de densidad electrónica de cada modelo coloreado según valores de resolución local. d, curva de correlaciones de capa de Fourier (FSC) para cada modelo. e, Fragmentos del mapa de densidad crio-EM y modelo atómico de TMC-1 y cada subunidad auxiliar. Los mapas crio-EM se muestran como una malla violeta.

a B C. Estructuras de TMEM16A (5OYB), OSCA1.2 (6MGV) y el complejo TMC-1 vistas desde las mismas perspectivas relativas. Las vistas laterales de las regiones transmembrana y las vistas de arriba hacia abajo se muestran en el modelo de dibujos animados. Los iones putativos se muestran como esferas rojas.

a, Las ubicaciones de las mutaciones de cisteína que perturban la conductancia del canal único de TMC-1 en ratones se muestran en el complejo TMC-1 de C. elegans. El número de residuo de C. elegans está etiquetado y el residuo de ratón correspondiente se indica entre paréntesis. b, La estructura del complejo TMC-1 y las ubicaciones de las mutaciones asociadas con la pérdida auditiva o la sordera. Las posiciones Cα de los residuos en cuestión se muestran como esferas amarillas (TMC-1), moradas (CALM-1) o azules (TMIE). c, Una tabla de los residuos que se muestran en el panel b. Las mutaciones relacionadas con la pérdida auditiva y la sordera en humanos están coloreadas en negro y azul, respectivamente.

a, Modelo de homología del complejo TMC-1 humano: TMC-1 (azul oscuro y azul claro), CIB2 (naranja y amarillo) y TMIE (rojo y rosa). b, Una vista ampliada de la supuesta vía de conducción iónica, destacando los residuos del revestimiento de los poros. Los residuos polares (amarillo), ácidos (rojo) y básicos (azul) se muestran como barras. c, el potencial electrostático de los residuos del revestimiento de los poros se representa en diferentes colores: gris = no polar, amarillo = polar, rojo = ácido, azul = básico. Los residuos ácidos, básicos y polares están etiquetados.

a, Un protómero de TMC-1 en la conformación E (azul) y la conformación C (verde), superpuestos en base a átomos de carbono alfa del esqueleto, destacando los cambios conformacionales en TMC-1, así como en CALM-1 y TMIE. El eje de rotación se muestra como una barra roja y las flechas indican la dirección de rotación desde el estado C al E. b, Espesor de la membrana en la conformación C calculado a partir de los últimos 500 ns de las trayectorias atomísticas MD, promediado en las tres réplicas de simulación. Los mapas de calor correspondientes al grosor de las valvas extracelulares y citoplasmáticas se muestran en los paneles izquierdo y derecho, respectivamente.

a, Cuatro complejos TMC-1 (gris) en la conformación E incrustados en una bicapa lipídica compuesta de PC, PE, SM y colesterol (CHOL) que se muestran en cian, amarillo, naranja y verde, respectivamente, con una relación molar de 32:54:8:6. b, Índices de enriquecimiento-agotamiento de cada componente lipídico en la proximidad de la proteína obtenidos de las simulaciones de las conformaciones E (barras sólidas) y C (barras rayadas). Las densidades de PC y PE en la masa y en las proximidades de la proteína son similares, mientras que la SM se agota y el CHOL se enriquece en las proximidades de la proteína en relación con sus concentraciones en masa. Los puntos de datos se muestran como puntos rojos. Las barras de media y error se calculan a partir de 1000 puntos de datos en cada gráfico de barras y las barras de error son desviaciones estándar de los datos. c, Mapas de calor que representan distribuciones de diferentes especies de lípidos alrededor de la proteína en la conformación E. Cada distribución se calcula a partir de los últimos 5 μs de la trayectoria y se promedia sobre las cuatro copias de proteínas. d y e, patrones de espesor calculados para las valvas extracelulares y citoplasmáticas promediadas durante los últimos 5 𝜇 de las trayectorias CG de las conformaciones E y C, respectivamente. La sección transversal de la proteína se muestra en rojo. La escala de colores representa el grosor de cada folíolo, correspondiendo el azul y el amarillo al adelgazamiento y al engrosamiento, respectivamente. Las conformaciones E y C generan diferentes patrones de deformación de la membrana.

Este archivo contiene Figs complementarias. 1–3.

Datos sin procesar para geles originales teñidos con plata y teñidos con Coomassie. a, gel original teñido con plata (consulte los datos ampliados en la figura 1b (recuadro)). b, gel teñido con Coomassie original (ver Fig. 2a complementaria). Los cuadros amarillos indican cómo se cortaron los geles.

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Jeong, H., Clark, S., Goehring, A. et al. Las estructuras del complejo TMC-1 iluminan la transducción mecanosensorial. Naturaleza 610, 796–803 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05314-8

Descargar cita

Recibido: 04 de mayo de 2022

Aceptado: 02 de agosto de 2022

Publicado: 12 de octubre de 2022

Fecha de emisión: 27 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05314-8

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